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与水稻互作的枯草芽孢杆菌OKB105菌株蛋白质组学研究

作　者: 陈丽娜
导　师: 高学文
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻 枯草芽孢杆菌OKB105菌株 互作 蛋白质组学
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类重要的植物根围促生细菌(PGPR),能够促进植物生长和防治植物病害,作为生物农药和生物肥料广泛应用。PGPR通过产生植物激素、挥发性化合物以及提高植物对养分的可利用性等方面来促进植物生长。本实验室此前发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) OKB105菌株处理模式植物烟草,能显著提高烟草的株高和鲜重。OKB105菌株全基因组分析表明,该菌株不含IAA、细胞分裂素和赤霉素等植物激素的合成基因簇,也不含有挥发性促生物质。故OKB105菌株产生的促生物质及作用机理可能与已报道的不同。本研究目的是建立OKB105菌株与水稻的互作体系,采用双向电泳技术来揭示OKB105菌株的促生机制。用不同浓度(105、106、107cfu·ml-1)的OKB105菌株的菌悬液处理水稻种子及幼苗根系,1周左右测量水稻的株高及根长。结果表明：当浓度达到106cfu·ml-1时对水稻的株高有明显的促生效果,与对照相比株高促生百分率达25.2%,105cfu·ml-1的OKB105菌悬液对水稻株高和根长均无明显促生效果,而107cfu·ml-1的OKB105菌悬液明显抑制了水稻的株高及根生长,这说明只有适当的芽孢杆菌浓度能够促进水稻生长。在此基础上,选择OKB105菌株与水稻互作,利用双向电泳技术研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)促进水稻生长的机理。双向电泳技术(Two-dimensional electrophoresis)成功的关键在于建立一套有效的、可重复的样品制备方法及合适的双向电泳条件。本研究利用水稻与OKB105菌株互作体系,对OKB105菌株胞内全蛋白的提取方法及双向电泳条件分别进行了优化。实验结果表明：溶菌酶结合超声波破碎的方法更适合革兰氏阳性细菌胞内全蛋白的提取,分离胶浓度为10%,等电聚焦(IEF)程序中最高电压8000V,聚焦60000Vh且增加低电压慢速除盐步骤能够提高双向电泳图谱质量,为蛋白质组学水平上研究水稻与芽孢杆菌的互作奠定了良好的基础。按照上述优化的方法,将与水稻互作后的OKB105菌株胞内全蛋白进行双向电泳,并通过PDQuest软件进行差异点比对分析。实验结果表明：与对照相比,枯草芽孢杆菌OKB105菌株胞内全蛋白双向电泳图谱有15个差异表达蛋白点,其中上调表达蛋白点13个,下调表达蛋白点2个。分别挖取这15个蛋白点进行质谱鉴定,结果发现了12个已知功能的蛋白点,它们分别在蛋白质分泌、群体感应系统、信号转导、外被蛋白形成、细胞分裂、激活基因转录、能量代谢等方面发挥着重要的作用。对这些鉴定蛋白的深入研究将有助于更好的认识OKB105菌株对水稻的促生机制。

全文目录


目录  4-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
上篇 文献综述  12-33
  第一章 植物根围促生细菌促生机理及其与植物的互作研究进展  13-25
    1 植物根围促生细菌(PGPR)对植物的促生作用  13-14
    2 植物根围促生细菌(PGPR)的促生机理  14-23
      2.1 PGPR能够提高植物对养分的可利用性  14-18
        2.1.1 嗜铁素的产生  14-17
        2.1.2 PGPR的解磷作用  17-18
        2.1.3 氮的利用  18
      2.2 PGPR能够产生挥发性化合物来促进植物生长  18-19
      2.3 植物激素  19-23
        2.3.1 生长素  19-21
        2.3.2 赤霉素  21-22
        2.3.3 细胞分裂素  22-23
        2.3.4 乙烯  23
    3 植物根围促生细菌(PGPR)与植物的互作  23-25
      3.1 竞争空间和营养物质  23
      3.2 定殖  23-24
      3.3 建立共生关系  24-25
  第二章 双向电泳技术及生物信息学分析  25-33
    1 双向电泳  25-29
      1.1 双向电泳原理  25-26
      1.2 双向电泳实验流程  26-28
        1.2.1 样品制备  26
        1.2.2 第一向等电聚焦(IEF)  26-27
        1.2.3 胶条的平衡  27
        1.2.4 第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  27
        1.2.5 凝胶的染色  27
        1.2.6 成像和软件分析  27
        1.2.7 蛋白鉴定  27-28
      1.3 双向电泳技术在蛋白质组学中的应用  28-29
    2 分子生物信息学分析  29-33
      2.1 分子生物信息学的历史  29-30
        2.1.1 分子生物信息学的产生  29-30
        2.1.2 分子生物信息学的发展  30
      2.2 分子生物信息学概念  30
      2.3 分子生物信息学的主要研究内容  30-31
      2.4 分子生物信息学信息处理流程  31-32
      2.5 分子生物信息学的应用及研究意义  32-33
        2.5.1 分子生物信息学的应用  32
        2.5.2 分子生物信息学的研究意义  32-33
下篇 研究内容  33-79
  第一章 枯草芽孢杆菌OKB105菌株与水稻互作体系的建立  35-43
    摘要  35-36
    1 材料与方法  36-38
      1.1 供试菌株及培养条件  36
      1.2 供试植物材料  36
      1.3 水稻培养方法  36-37
        1.3.1 蛭石混土法培养水稻  36
        1.3.2 植物组织培养基N6培养水稻  36-37
        1.3.3 水培法培养水稻  37
      1.4 水稻与枯草芽孢杆菌OKB105菌株互作体系  37-38
      1.5 枯草芽孢杆菌OKB105菌株对水稻促生的表型实验  38
      1.6 枯草芽孢杆菌OKB105菌株平板检测实验  38
    2 结果与分析  38-41
      2.1 水稻最优培养方法及互作体系的确立  38-39
      2.2 OKB105菌株促进水稻的生长  39-40
      2.3 与水稻互作的枯草芽孢杆菌OKB105菌株平板检测结果  40-41
    3 讨论  41-42
    ABSTRACT  42-43
  第二章 OKB105菌株胞内全蛋白样品制备及双向电泳条件优化  43-65
    摘要  43
    1 材料与方法  43-57
      1.1 菌株及培养条件  43
      1.2 培养基  43-44
      1.3 主要试剂  44
      1.4 供试胶条  44
      1.5 缓冲液  44-46
      1.6 OKB105菌株胞内全蛋白的提取  46-47
        1.6.1 超声波破碎法提取蛋白  46
        1.6.2 液氮研磨法提取蛋白  46-47
        1.6.3 溶菌酶结合超声波破碎法提取蛋白  47
      1.7 SDS-PAGE凝胶电泳检测  47-49
      1.8 OKB105菌株胞内全蛋白纯化  49-50
      1.9 OKB105菌株胞内全蛋白定量  50
      1.10 一向等电聚焦  50-52
        1.10.1 胶条溶胀  50-51
        1.10.2 等电聚焦  51-52
        1.10.3 胶条的保存  52
      1.11 二向SDS-PAGE  52-56
        1.11.1 灌胶前的准备  52
        1.11.2 灌胶  52-53
        1.11.3 玻璃板、电泳槽的准备  53-54
        1.11.4 胶条平衡  54-55
        1.11.5 胶条转移  55
        1.11.6 SDS-PAGE电泳  55-56
      1.12 染色  56-57
        1.12.1 考马斯亮蓝R250染色法  56
        1.12.2 银染法  56-57
      1.13 凝胶的保存  57
    2 结果与分析  57-61
      2.1 OKB105菌株胞内全蛋白的提取  57-58
      2.2 OKB105菌株胞内全蛋白的纯化及浓度测定  58-59
      2.3 蛋白上样浓度的优化  59-60
      2.4 蛋白胶浓度的优化  60
      2.5 等电聚焦程序的优化  60-61
    3 讨论  61-63
    ABSTRACT  63-65
  第三章 与水稻互作的OKB105菌株胞内全蛋白差异表达蛋白点生物信息学分析  65-79
    摘要  65
    1 材料与方法  65-66
      1.1 菌株及培养条件  65
      1.2 培养基  65-66
      1.3 主要试剂  66
      1.4 供试胶条  66
      1.5 缓冲液  66
      1.6 水稻培养方法  66
      1.7 枯草芽孢杆菌OKB105胞内全蛋白提取、纯化及定量方法  66
      1.8 双向电泳实验条件  66
      1.9 水稻与枯草芽孢杆菌OKB105互作  66
      1.10 与水稻互作的OKB105菌株胞内全蛋白双向电泳图像分析  66
      1.11 质谱分析  66
    2 结果与分析  66-74
      2.1 与水稻互作的OKB105菌株胞内全蛋白双向电泳  66-68
      2.2 差异蛋白点比对  68-69
      2.3 差异表达蛋白点分析  69-74
    3 讨论  74-78
      3.1 细菌群体感应系统相关蛋白  74-75
      3.2 细菌蛋白质合成、分泌相关蛋白  75
      3.3 细菌细胞分裂相关蛋白  75-76
      3.4 细菌生长代谢相关蛋白  76-77
      3.5 功能未知蛋白  77-78
    ABSTRACT  78-79
参考文献  79-91
附录  91-93
致谢  93-95
攻读硕士期间发表的学术论文  95

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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