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重组Thermobifida fusca角质酶的高效胞外表达及其分子机制

作　者: 宿玲恰
导　师: 吴敬
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 角质酶 大肠杆菌 重组蛋白 胞外表达 高效制备
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


角质酶是一种多功能酶，能够催化各类聚酯、不溶性的甘油三酯和小分子可溶性酯类物质的水解反应，多种酸和醇的酯化反应以及酯和醇的酯交换反应，在纺织、洗涤剂、酯合成以及环保等诸多领域具有广泛的应用前景。然而，目前市场上并无商品化的角质酶制剂出售，角质酶的制备尚处于实验室研究阶段。本实验室前期研究中发现嗜热单孢菌(Thermobifida fusca)来源的角质酶热稳定性好，pH适用范围宽，尤其适合在纺织工业中的应用；此外，为了实现角质酶的高效表达，进一步鉴定了角质酶编码基因，构建了采用大肠杆菌II型分泌系统中的Sec途径介导角质酶分泌表达的重组菌，并进行了初步的摇瓶发酵条件优化。本论文立足于前期工作积累，基于大肠杆菌蛋白跨膜分泌机制和T. fusca角质酶自身特性，研究了角质酶的高效胞外分泌型表达策略及其在强化其他重组蛋白胞外表达中的应用，主要研究结果如下：(1)大肠杆菌II型分泌系统介导的角质酶的分泌表达：考察了Sec途径介导角质酶分泌表达的重组菌在3L罐发酵产酶的情况，结果显示不同诱导温度以及添加甘氨酸等因素对角质酶的胞外产量无明显影响，培养基上清中的角质酶酶活最高为238.8U mL-1，占总酶活(培养基上清和细胞内的角质酶酶活之和)的13.6%，生产强度为7.5U mL-1h-1；进一步构建了II型分泌系统中的Tat途径介导角质酶分泌表达的重组菌，摇瓶发酵结果显示，角质酶的胞外产量和分泌比例均低于Sec途径介导时的胞外分泌水平；以Sec途径介导角质酶分泌表达时为例，采用不同方式处理发酵结束的细胞，胞内的角质酶能够释放至胞外的比例最高为24.8%；为了提高角质酶的分泌性能，对角质酶进行了分子改造，选择活性中心附近或底物结合位点的疏水氨基酸(Y60、L90、I178、F209、I213)分别突变为丙氨酸，然而，研究表明，各突变体的分泌情况无明显改善。(2)大肠杆菌I型分泌系统介导的角质酶的分泌表达：构建了大肠杆菌I型分泌系统介导角质酶分泌表达的重组菌，摇瓶发酵表明角质酶的胞外产量为Sec途径介导时的2.5倍；此外，由于I型分泌系统介导的蛋白分泌过程完成后信号肽HlyAs并不切除，因此将角质酶-HlyAs进行了分离纯化，并与天然角质酶对比分析，结果表明，HlyAs对角质酶的酶学性质和应用性能无明显影响；将上述重组菌在3L罐进行发酵条件优化，采用一次性添加0.04mmol L-1IPTG并以0.5g L-1h-1的流速流加乳糖的诱导策略，培养基中角质酶酶活为596.6U mL-1，占总酶活的45.8%，生产强度达到19.2U mL-1h-1，为II型分泌系统介导角质酶分泌时3L罐发酵水平的2.6倍。(3)无信号肽介导的角质酶的“分泌”表达：构建了无任何信号肽介导的角质酶(角质酶NS)表达的重组菌，摇瓶发酵表明角质酶的胞外“分泌”量达到总酶活的92.5%；将角质酶NS进行了分离纯化和酶学定性，结果显示角质酶NS与天然酶的酶学性质无明显区别；在此基础上，考察了上述重组菌在3L罐发酵情况，结果表明培养基中角质酶活力达到1063.5U mL-1，占总酶活的69.8%，生产强度为40.9U mL-1h-1，分别是I型和II型分泌系统介导角质酶分泌时生产强度的2.1倍和5.5倍；为进一步提高角质酶的表达水平，将角质酶NS基因进行密码子优化，并将优化后的角质酶NS基因在大肠杆菌中重组表达，在3L罐发酵时培养基中角质酶产量提高至1765.7U mL-1，为优化前的1.7倍，分泌比例达到87.0%，生产强度为64.2U mL-1h-1，本研究结果是迄今为止国内外关于角质酶制备研究中的最高产酶水平，实现了角质酶的高效胞外“分泌”型表达。(4)无信号肽介导的角质酶“分泌”机制的探究：通过定点突变获得了失活的角质酶NSS130A突变体，SDS-PAGE凝胶电泳分析发现，绝大部分角质酶NSS130A定位于细胞质中；此外，研究表明，角质酶能够水解大肠杆菌细胞膜磷脂主要组分磷脂酰乙醇胺；通过与对照菌对比发现，当大肠杆菌表达角质酶NS时，细胞膜通透性显著增强，细胞呈现不规则形状，但并无明显的裂解现象；基于上述研究结果，提出了角质酶NS“通过对磷脂的限制性水解使细胞膜透性增强从而非特异性渗漏至培养基”的“分泌”机制；进一步研究发现当与角质酶NS共表达时，胞内蛋白D-木糖异构酶和海藻糖合酶也能够释放至胞外培养基中，从而证实了角质酶NS的“分泌”具有非特异性。(5)共表达角质酶促进天然分泌型蛋白的胞外表达：分别构建了携带pelB信号肽的木聚糖酶和α-淀粉酶单独表达以及与角质酶NS共表达的重组菌，摇瓶发酵结果显示，共表达系统的木聚糖酶和α-淀粉酶的生产强度分别为对照菌的7.9倍和2.0倍，并且产酶水平的提升与细胞裂解无关。将目的蛋白分离纯化并进行N端测序，发现目的蛋白的N末端氨基酸均与成熟蛋白的理论氨基酸一致，表明pelB信号肽能够成功切除。此外，为了考察共表达系统中pelB信号肽是否必需，构建了无信号肽的目的蛋白和角质酶NS共表达的重组菌，摇瓶发酵显示所有目的蛋白表达产物均形成了无活性的包涵体。本研究为强化重组分泌型蛋白的胞外表达提供了一种新思路。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第一章 绪论  10-19
  1.1 角质酶概述  10-13
    1.1.1 角质酶的结构与功能  10
    1.1.2 角质酶的应用  10-11
    1.1.3 角质酶的制备  11-13
  1.2 大肠杆菌分泌表达重组蛋白概述  13-17
    1.2.1 大肠杆菌蛋白分泌系统  13-16
    1.2.2 强化蛋白分泌的策略  16-17
  1.3 本论文的主要研究内容  17-19
    1.3.1 立题依据及研究意义  17
    1.3.2 本论文的主要研究内容  17-19
第二章 大肠杆菌 II 型分泌系统介导的角质酶的分泌表达  19-31
  2.1 引言  19
  2.2 材料和方法  19-23
    2.2.1 菌株和质粒  19
    2.2.2 试剂和仪器  19-20
    2.2.3 培养基和培养条件  20-21
    2.2.4 重组质粒的构建  21-22
    2.2.5 定点突变  22
    2.2.6 分析方法  22
    2.2.7 不同细胞组分的制备  22-23
  2.3 结果与讨论  23-29
    2.3.1 Sec 途径介导的角质酶的分泌表达  23-24
    2.3.2 Tat 途径介导的角质酶的分泌表达  24-26
    2.3.3 采用不同策略处理细胞促进细胞内角质酶的释放  26-28
    2.3.4 定点突变提高角质酶分泌性能的尝试  28-29
  2.4 本章小结  29-31
第三章 大肠杆菌 I 型分泌系统介导的角质酶的分泌表达  31-42
  3.1 引言  31
  3.2 材料和方法  31-33
    3.2.1 菌株和质粒  31
    3.2.2 试剂和仪器  31
    3.2.3 培养基和培养条件  31-32
    3.2.4 重组质粒的构建  32
    3.2.5 定点突变  32
    3.2.6 重组蛋白的分离纯化  32
    3.2.7 分析方法  32-33
    3.2.8 不同细胞组分的制备  33
  3.3 结果与讨论  33-41
    3.3.1 重组质粒的构建  33-35
    3.3.2 角质酶-HlyAs 的诱导表达  35-36
    3.3.3 角质酶-HlyAs 的分离纯化  36-37
    3.3.4 角质酶-HlyAs 的酶学性质  37-38
    3.3.5 角质酶-HlyAs 的应用性能—棉织物的润湿性  38-39
    3.3.6 重组大肠杆菌胞外表达角质酶-HlyAs 的 3 L 罐发酵  39-41
  3.4 本章小结  41-42
第四章 无信号肽介导的角质酶的“分泌”表达  42-51
  4.1 引言  42
  4.2 材料和方法  42-43
    4.2.1 菌株和质粒  42
    4.2.2 试剂和仪器  42
    4.2.3 培养基和培养条件  42
    4.2.4 重组质粒的构建  42
    4.2.5 重组蛋白的分离纯化  42-43
    4.2.6 分析方法  43
    4.2.7 不同细胞组分的制备  43
  4.3 结果与讨论  43-49
    4.3.1 重组质粒的构建  43-44
    4.3.2 角质酶NS的诱导表达  44-45
    4.3.3 角质酶NS的分离纯化  45-46
    4.3.4 角质酶NS的酶学定性  46-47
    4.3.5 重组大肠杆菌胞外表达角质酶NS的 3 L 罐发酵  47
    4.3.6 角质酶NS的基因优化及其表达  47-49
  4.4 本章小结  49-51
第五章 无信号肽介导的角质酶“分泌”机制的探究  51-64
  5.1 前言  51
  5.2 材料与方法  51-53
    5.2.1 菌株和质粒  51
    5.2.2 试剂和仪器  51
    5.2.3 培养基和培养条件  51
    5.2.4 重组质粒的构建  51-52
    5.2.5 定点突变  52
    5.2.6 分析方法  52-53
    5.2.7 不同细胞组分的制备  53
  5.3 结果与讨论  53-63
    5.3.1 失活的角质酶NS突变体 S130A 的表达  53-55
    5.3.2 角质酶具有磷脂水解活性  55-57
    5.3.3 角质酶NS的表达对 E. coli 细胞膜具有一定的破坏作用  57-58
    5.3.4 角质酶NS的“分泌”属于非特异性渗漏  58-63
  5.4 本章小结  63-64
第六章 共表达角质酶促进天然分泌型蛋白的胞外表达  64-77
  6.1 引言  64
  6.2 材料和方法  64-66
    6.2.1 菌株和质粒  64
    6.2.2 试剂和仪器  64
    6.2.3 培养基和培养条件  64
    6.2.4 重组质粒的构建  64-65
    6.2.5 重组蛋白的分离纯化  65
    6.2.6 分析方法  65-66
    6.2.7 不同细胞组分的制备  66
  6.3 结果与讨论  66-76
    6.3.1 木聚糖酶与角质酶的共表达  66-71
    6.3.2 α-淀粉酶与角质酶的共表达  71-76
  6.4 本章小结  76-77
主要结论与展望  77-79
  主要结论  77-78
  展望  78-79
论文主要创新点  79-80
致谢  80-81
参考文献  81-88
附录  88

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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