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产GSH酿酒酵母的微生物育种

作　者: 魏咏新
导　师: 袁建国
学　校: 山东师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 谷胱甘肽酿酒酵母基因组重排条件优化
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸三种氨基酸组成，具有重要的生理功能，广泛分布于动植物细胞和微生物细胞中。谷胱甘肽具有清除自由基、解毒、延缓衰老和抗疲劳等多种生理功效。在临床上用于肝脏保护、治疗肿瘤和内分泌紊乱等疾病。谷胱甘肽的生产方法有多种，目前生产上最常用的是发酵法。发酵法生产谷胱甘肽的基础是选育一株稳定高产的优良菌株。基因组重排育种技术是在上个世纪90年代被提出，该技术将传统诱变育种与原生质体融合技术有机结合，大大加快菌株正向突变的进程。国内学者针对这种技术的研究还比较少，在选育谷胱甘肽高产菌株方面还没有相关的文献记载。本文采用基因组重排育种技术对酿酒酵母进行微生物育种，旨在选育出高产、生长周期短、生产性能稳定的高产GSH优良菌株。研究的主要内容及结果如下：1、将现有保藏的产GSH菌株活化后，经10次传代培养筛选出相对高产且遗传稳定的菌株编号Y1和Y2作为出发菌株，Y1和Y2的GSH产量分别为261.47mg/L和600.13mg/L。对酿酒酵母Y1和Y2单倍体制备条件进行了研究。确定了单倍体制备条件:Y1和Y2分别用2%和1.5%蜗牛酶作用75min和90min，酶解后55℃分别加热8min和10min，单倍体制备率均达到100%。2、通过探究了单倍体Y1-110和Y2-206原生质体形成与再生的影响因素，确定了单倍体Y1-110和Y2-206原生质体制备的条件为：Y1-110和Y2-206的菌悬液分别预处理20min和25min，渗透压浓度分别为0.45mol/L和0.50mol/L，2%蜗牛酶+1%纤维素酶共同酶解时间分别为3h和4h，其原生质体形成率分别为88.02%和90.00%，再生率分别为51.70%和47.86%。3、进行了基因组重排实验，利用原生质体灭活的筛选方法进行目的融合菌株的筛选。确定了原生质体灭活的条件分别为：Y1-110和Y2-206的原生质体热灭活处理条件分别为65℃处理3min和5min，紫外灭活处理时间分别为90s和120s。原生质体融合的最佳条件为：在28~30℃下，用35%的PEG6000处理120min，融合率达到3.23×10-4%。在进行了三轮基因组重排、抗性筛选及遗传稳定性筛选后，得到一株稳定高产的抗ZnCl2重排菌株YR-1，其GSH产量为679.95mg/L，比Y1产量提高了160.05%，比Y2提高了13.30%。非基因组重排对照实验也证明了F3代的优良表型确实是通过基因组重排育种技术实现的。4、通过单因素实验和正交试验对重排菌株YR-1的发酵培养基及发酵条件进行了优化，优化后的发酵培养基组成为：葡萄糖4.6%、酵母粉2.4%，磷酸氢二钾0.21%，磷酸二氢钾0.30%，硫酸镁0.05%，发酵GSH产量达到730.12mg/L，比原始重排菌株GSH产量提高了7.38%。初步确定最佳发酵条件为：培养温度28℃，初始pH值5.5，接种量10%，装液量30mL/250mL，摇床转速120r/min，在此条件下，发酵周期为36h，重排菌株的GSH产量达到750.65mg/L，比优化前提高了2.81%。

全文目录

目录  4-8
缩略词表  8-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章文献综述  13-27
  1.1 谷胱甘肽的结构与理化性质  13
  1.2 谷胱甘肽的生理功能及应用  13-15
    1.2.1 谷胱甘肽的生理功能  13-14
    1.2.2 谷胱甘肽的应用  14-15
  1.3 谷胱甘肽的制备、检测及市场展望  15-20
    1.3.1 谷胱甘肽的制备  15-18
    1.3.2 谷胱甘肽的检测  18-19
    1.3.3 谷胱甘肽的市场展望  19-20
  1.4 谷胱甘肽生产菌株的选育  20-22
    1.4.1 谷胱甘肽的生产菌株  20
    1.4.2 谷胱甘肽高产菌株的选育  20-22
  1.5 基因组重排育种研究概况  22-24
    1.5.1 基因组重排技术的原理  23
    1.5.2 基因组重排的方法  23
    1.5.3 基因组重排育种的优点和问题  23-24
  1.6 本研究的立题依据和研究内容  24-27
    1.6.1 立题依据  24
    1.6.2 研究内容  24-25
    1.6.3 技术路线  25-27
第二章菌株筛选及单倍体制备条件优化  27-39
  前言  27
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 菌株来源  27-28
    2.1.2 仪器设备  28
    2.1.3 实验药品与试剂  28-29
    2.1.4 培养基  29
  2.2 实验方法  29-31
    2.2.1 菌种筛选  29-30
    2.2.2 谷胱甘肽的测定—DTNB 法  30
    2.2.3 单倍体制备  30-31
  2.3 结果与分析  31-37
    2.3.1 谷胱甘肽标准曲线的绘制  31
    2.3.2 出发菌株筛选结果  31-32
    2.3.3 出发菌株生长曲线的测定  32-33
    2.3.4 酶浓度及酶解时间对单倍体制备的影响  33-34
    2.3.5 酶解后加热处理对单倍体制备的影响  34-36
    2.3.6 双倍体与单倍体的显微观察对比  36-37
  2.4 本章小结  37-39
第三章单倍体的原生质体制备与再生条件优化  39-49
  前言  39
  3.1 实验材料  39-40
    3.1.1 菌株来源  39
    3.1.2 仪器设备  39
    3.1.3 实验药品与试剂  39-40
    3.1.4 培养基  40
  3.2 实验方法  40-41
    3.2.1 原生质体的制备  40-41
    3.2.2 原生质体的再生  41
    3.2.3 原生质体形成率与再生率计算：  41
  3.3 结果与分析  41-47
    3.3.1 预处理时间对原生质体制备及再生的影响  41-43
    3.3.2 酶种类与酶浓度对原生质体制备及再生的影响  43-44
    3.3.3 酶解时间对原生质体制备及再生的影响  44-45
    3.3.4 渗透压对原生质体制备及再生的影响  45-47
    3.3.5 原生质体的显微观察  47
  3.4 本章小结  47-49
第四章谷胱甘肽产生菌的基因组重排技术育种  49-59
  前言  49
  4.1 实验材料  49-50
    4.1.1 菌株来源  49-50
    4.1.2 仪器设备  50
    4.1.3 实验药品与试剂  50
    4.1.4 培养基  50
  4.2 实验方法  50-53
    4.2.1 单倍体制备及原生质体制备  50-51
    4.2.2 原生质体的灭活  51
    4.2.3 原生质体的融合  51
    4.2.4 融合率的计算  51-52
    4.2.5 基因组重排及高产融合子的筛选  52
    4.2.6 非基因组重排对照试验  52
    4.2.7 重排菌株遗传稳定性的测定  52-53
  4.3 结果与分析  53-58
    4.3.1 原生质体的最佳灭活条件  53-55
    4.3.2 融合温度对融合率的影响  55
    4.3.3 聚乙二醇 6000 浓度与融合率的关系  55-56
    4.3.4 聚乙二醇（PEG）作用时间与融合率的关系  56-57
    4.3.5 原生质体融合过程的显微观察  57
    4.3.6 基因组重排及高产融合子的筛选  57-58
    4.3.7 非基因组重排对照实验  58
    4.3.8 重排菌株遗传稳定性的测定  58
  4.4 本章小结  58-59
第五章重排菌株发酵培养基及发酵条件的优化  59-73
  前言  59
  5.1 实验材料  59-60
    5.1.1 菌株来源  59
    5.1.2 仪器设备  59
    5.1.3 培养基  59-60
  5.2 实验方法  60-61
    5.2.1 菌种培养  60
    5.2.2 培养基优化单因素实验  60
    5.2.3 发酵条件优化  60-61
  5.3 结果与分析  61-71
    5.3.1 谷胱甘肽标准曲线的绘制  61
    5.3.2 重排菌株 YR-1 发酵培养基的优化  61-64
    5.3.3 设计正交试验确定最佳发酵培养基成分  64-67
    5.3.4 重排菌株 YR-1 发酵培养条件的优化  67-71
  5.4 本章小结  71-73
第六章结论及展望  73-75
参考文献  75-81
攻读学位期间发表的学术论著  81-83
致谢  83

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