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一株百菌清降解菌株的分离鉴定及其对土壤中百菌清污染的修复研究

作　者: 张晓菲
导　师: 蒋建东
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 百菌清降解 Pseudomonas sp.BJQ-3 羟基百菌清生物修复
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

从江苏省新沂市丰乐化工有限公司长期受百菌清污染的土壤中分离、筛选到1株百菌清的高效降解菌株BJQ-3,根据其生理生化特性以及16S rRNA基因的系统发育分析,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。对菌株BJQ-3的生物学特性进行了研究,菌株BJQ-3的最适生长温度为30℃,最适pH值为7.0,NaCl浓度为1-3%,对葡萄糖、丁二酸钠和乙酸钠等碳源利用最好,对蛋白胨和酵母汁有机氮源利用最好,对硫酸铵无机氮源利用最好,菌株BJQ-3抗生素抗性谱较窄,对30mgL-1的氯霉素有抗性,而对50mgL-1的链霉素、壮观霉素和庆大霉素、30mgL-1的四环素、100mgL-1的卡那霉素和氨苄霉素无抗性。系统研究了菌株BJQ-3对百菌清的降解特性,菌株BJQ-3不能利用百菌清为唯一碳源生长,但以非共代谢方式高效降解百菌清。菌株BJQ-3可以在48h降解95.6%的50mgL-1的百菌清,在20-40℃条件下对百菌清都有降解效果,35℃时降解效果最好；最适降解的pH值为6.0-7.0,pH低于5.0的酸性条件下不利于降解,pH8.0-9.0的偏碱性条件下降解良好；添加可选择性的碳、氮源可以促进百菌清降解,但非降解所必需,与共代谢降解机制不同。通过紫外扫描和高效液相色谱(HPLC)图谱比对和脱氯实验验证等方法,将百菌清的降解产物鉴定为羟基百菌清(CTN-OH),表明菌株BJQ-3能将百菌清的的一个氯原子脱除生成羟基。采用454高通量测序技术,研究百菌清长期污染和菌株BJQ-3修复百菌清污染土壤对细菌群落结构影响。研究发现,长期受百菌清污染的土壤中,变形菌门Proteobacteri、放线菌门Actinobacteria、硬壁菌门Firmicutes细菌比例增加,而酸杆菌门Actinobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、浮霉菌门Planctomycetes、拟杆菌门Bacteroidetes、硝化螺旋菌门Nitrospira、Candidate division WS3、疣微菌门Verrucomicrobia.氰基细菌门Cyanobacteria比例显著降低,绿弯菌门Chloroflexi细菌变化不显著。接种7.45±0.55×107CFU g-1菌株BJQ-3到人为添加浓度为50mgkg-1的百菌清土壤中,30d可将百菌清降解到检测不出的水平。通过对土壤中细菌群落多样性分析,发现50mgkg-1干土的百菌清的施加会对土壤细菌多样性造成显著影响,百菌清的污染导致硝化细菌、蓝细菌门的细菌数量下降,而百菌清耐受性细菌比例上升,添加BJQ-3可部分恢复百菌清对细菌群落的影响。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
符号与缩略语说明  12-13
前言  13-14
文献综述  14-26
  一、杀菌剂的种类和污染情况  14-17
    1 杀菌剂的种类  14-15
    2 杀菌剂的污染情况  15-16
    3 百菌清及其污染情况  16-17
  二、百菌清特性  17-20
    1 百菌清的化学结构  17
    2 百菌清的理化性质  17-18
    3 百菌清在土壤中的环境行为  18-19
    4 百菌清污染土壤的特点  19-20
    5 百菌清的土壤微生物降解的影响因素  20
  三、百菌清的生物降解研究进展  20-26
    1 百菌清在环境中的降解  21-22
    2 百菌清降解菌株的分离  22-23
    3 百菌清代谢途径  23-24
    4 百菌清降解基因和水平转移  24-26
      4.1 百菌清脱氯反应机制和脱氯酶基因  24-25
      4.2 百菌清水解脱氯酶(Chd)基因的水平转移  25-26
实验部分  26-58
  第一章百菌清降解菌株的分离与鉴定  26-36
    1 材料与方法  26-30
      1.1 培养基与试剂  26-27
      1.2 降解菌株的富集与分离  27
      1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定  27
      1.4 降解菌株的16S rRNA基因序列的测定  27-28
        1.4.1 菌体基因组DNA的提取  27
        1.4.2 降解菌株16S rRNA基因的PCR扩增及测序  27-28
      1.5 降解菌株系统发育地位的确定  28
      1.6 菌体生长量的测定  28
      1.7 百菌清含量测定方法  28-29
        1.7.1 紫外扫描检测  28
        1.7.2 高效液相色谱检测  28-29
      1.8 菌株BJQ-3生长特性的研究方法  29-30
    2 结果与分析  30-35
      2.1 百菌清降解菌株的富集与分离  30
      2.2 降解菌株的菌落形态及生理生化特征  30-31
      2.3 降解菌株BJQ-3的16S rRNA基因的PCR扩增  31
      2.4 降解菌株的系统分类地位鉴定  31-32
      2.5 环境条件对降解菌株生长的影响  32-35
        2.5.1 温度对菌株BJQ-3生长的影响  32-33
        2.5.2 初始pH值对菌株BJQ-3生长的影响  33
        2.5.3 NaCl浓度对菌株BJQ-3生长的影响  33-34
        2.5.4 不同碳源对菌株BJQ-3生长的影响  34
        2.5.5 不同氮源对菌株BJQ-3生长的影响  34-35
      2.6 菌株BJQ-3对抗生素的耐受性  35
    3 小结  35-36
  第二章降解菌株对百菌清的降解特性研究  36-44
    1 材料与方法  36-37
      1.1 培养基与试剂  36
      1.2 菌株BJQ-3降解特性的研究方法  36-37
      1.3 百菌清代谢产物的紫外和液相检测方法  37
      1.4 降解菌株的脱氯实验验证  37
    2 结果与讨论  37-43
      2.1 菌株生长和百菌清降解的关系  37-38
      2.2 温度对菌株BJQ-3降解百菌清的影响  38-39
      2.3 初始pH值对菌株BJQ-3降解百菌清的影响  39
      2.4 外加碳源对菌株BJQ-3降解百菌清的影响  39-40
      2.5 外加氮源对菌株BJQ-3降解百菌清的影响  40-41
      2.6 菌株对百菌清降解的产物鉴定  41-42
      2.7 降解菌株BJQ-3对百菌清脱氯的验证  42-43
    3 小结  43-44
  第三章降解菌株修复土壤中百菌清污染的生态学研究  44-58
    1 材料与方法  44-48
      1.1 供试土壤  44
      1.2 培养基与试剂  44-45
      1.3 主要仪器  45
      1.4 土壤样品理化性质的检测  45
      1.5 百菌清的长期污染对土壤微生物菌落结构影响  45-47
        1.5.1 土壤样品DNA的提取方法  45
        1.5.2 测序样品的准备  45-46
        1.5.3 Roche 454高通量测序  46-47
        1.5.4 高通量测序结果数据分析  47
      1.6 土壤中百菌清的提取和检测  47
      1.7 降解菌株修复百菌清污染土壤的生态学研究  47-48
        1.7.1 接种降解菌株对百菌清污染土壤的降解  47-48
        1.7.3 Roche 454高通量测序  48
        1.7.4 高通量测序结果数据分析  48
    2 结果与分析  48-56
      2.1 供试土壤的理化性质  48-49
      2.2 百菌清的长期污染对土壤细菌菌落结构的影响  49-52
        2.2.1 测序结果统计  49
        2.2.2 微生物多样性分析  49-50
        2.2.3 微生物群落结构分析  50-52
      2.3 降解菌修复百菌清污染土壤的生态学研究  52-56
        2.3.1 降解菌株在土壤中对百菌清的降解效果  52
        2.3.2 测序结果的统计分析  52-53
        2.3.3 微生物多样性及丰富度分析  53
        2.3.4 微生物群落结构分析  53-56
    3 小结与讨论  56-58
全文总结  58-60
附录一文中所用培养基及试剂配方  60-62
附录二相关DNA序列  62-64
参考文献  64-72
致谢  72

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