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人类磷酸核糖焦磷酸合成酶PRS1及其相关蛋白的结构与功能研究

作　者: 陈朋
导　师: 滕脉坤
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PRS1 晶体结构电镜结构 D52H突变致病机制 ADP抑制 PAP39
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

磷酸核糖焦磷酸合成酶PRS(负责催化ATP和核糖5磷酸R5P生成AMP与磷酸核糖焦磷酸PRPP)对于核苷酸,脱氧核苷酸以及它们的衍生物的生物合成都是必不可少的。人类的PRS1的单碱基突变与诸多的疾病,诸如高尿酸血症和痛风,CMTX5综合征,Arts综合征,X染色体连锁的非综合的感神经性耳聋DFN2乃至癌症等直接关联。但是PRS1的催化机制和可能的致病机制目前尚不清楚。我们利用X射线晶体学方法解析了人源野生型PRS1、疾病相关突变体的晶体结构,并利用冷冻电镜方法重构了它们的四级结构。结合PRS1或者其与不同底物或者抑制剂分子复合物(PRS1, PRS1-AMPNPP, PRS1-AMPNPP-R5P, PRS1-ADP)的不同构象的负染电镜结构,证实了前人提出的可能PRS1六聚体为其发挥生物学功能单位的推论,提出了四级结构的相互作用界面。综合基因突变、生化分析和序列比对的信息,阐明了其与底物和抑制剂相互作用的区域,提出了一种可能的PRS1催化及产物PRPP释放的机制。该研究结果对于理解由单点突变导致疾病的发生机制具有重要意义并对由PRS1突变引起的疾病治疗和药物设计提供了参考。PRS1D52H突变将会导致病人红细胞中PRPP浓度显著提高并最终引起高尿酸血症和严重的痛风疾病。D52H突变体的晶体结构显示PRS1第52位天冬氨酸被组氨酸替代的突变可能会完全破坏原先其周围稳定的相互作用网络。酶活实验表明D52H突变体和野生型的PRS1具有类似的催化活力。结合结构比对并通过酶活实验和等温滴定微量热实验证实这种相互作用网络的改变会进一步影响病人PRS1的ADP结合口袋的构象并降低其对抑制剂ADP的敏感性。这一结果很好的解释了PRS1D52H突变体的致病机制,同时也是对于上一篇提出模型的验证。与PRS1可能相互作用的蛋白包括PAP39, PAP41, PRS2, PRS3以及p300KIX结构域。PAP39一直都是作为PRS1可能的负调控蛋白被报道,而PRS1与p300KIX结构域相互作用对酶活的影响未见报道。我们通过PAP39pull down实验证实PAP39可以和PRS1在体外以1：1摩尔比相互作用,并分析了它们的酶动力学作用,结果表明,PAP39应该是PRS1的激活蛋白。我们还通过C端6his标签的PRS1pull down实验证实PRS1可以和KIX结构域在体外以1：1摩尔比相互作用。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
第一篇人类PRS催化和调节机制的结构生物学基础研究  11-63
  第1章 PRS1研究进展  11-23
    1.1 PRS是一类重要的酶  11-12
      1.1.1 PRS1催化的反应  11
      1.1.2 PRS的催化产物PRPP是众多反应的共同底物  11-12
    1.2 PRS家族蛋白  12-13
    1.3 人类PRS分类  13
    1.4 人的PRS1与若干重大疾病之间的直接关系  13-17
      1.4.1 PRS1超活性疾病  14-15
      1.4.2 Arts综合征  15-16
      1.4.3 CMTX5或者Rosenberg-Chutorian综合征  16-17
      1.4.4 DFN2综合征  17
      1.4.5 PRS1超活性与Arts综合征兼有的新突变  17
      1.4.6 PRS1与癌症的关系  17
    1.5 PRS1突变引起疾病目前的临床治疗方案  17-19
    1.6 PRS结构生物学研究进展  19-21
    1.7 本篇拟解决的问题  21-23
  第2章 PRS1的催化机制及可能的致病机理研究  23-57
    2.1 实验材料与方法  23-28
      2.1.1 人类PRS1蛋白的基因克隆及表达质粒的构建  23-25
      2.1.2 PRS1及其突变体蛋白的表达及纯化  25-26
      2.1.3 晶体生长及数据收集  26
      2.1.4 PRS1及其突变体的结构解析  26-27
      2.1.5 PRS1及其底物复合物的电镜样品制备、数据收集及三维重构  27
      2.1.6 PRS1及相关突变体的酶酶动力学常数测定  27-28
    2.2 实验结果  28-46
      2.2.1 PRS1蛋白纯化及纯度鉴定  28
      2.2.2 PRS1晶体的初筛及优化  28-29
      2.2.3 PRS1及其突变体的结构解析及模型质量评估  29-32
      2.2.4 野生型PRS1的整体结构  32-34
      2.2.5 PRS1及其与不同底物的负染电镜照片结构  34-35
      2.2.6 PRS1电镜结构的三维重构  35-36
      2.2.7 PRS1的六体四级结构相互作用面  36-38
      2.2.8 PRS1的活性位点  38-43
      2.2.9 PRS家族蛋白中存在的两种构象变化  43-44
      2.2.10 RS1突变体E43T,D65N,A87T,M115T和Q133P的晶体结构  44-46
    2.3 实验结果讨论  46-57
      2.3.1 六聚体是PRS1发挥功能的基本单位  47-48
      2.3.2 PRS1催化机制模型  48-54
      2.3.3 PRS1与疾病相关突变体分析  54-57
  本篇小结  57-58
  参考文献  58-63
第二篇 PRS1 D52H突变的致病机理研究  63-83
  第1章 PRS1突变引起疾病的致病机制研究进展  63-69
    1.1 PRS1的致病突变体  63
    1.2 PRS1若干突变体的致病机制研究进展  63-67
    1.3 本篇拟解决的问题  67-69
  第2章 PRS1 D52H突变的致病机理研究  69-79
    2.1 实验材料与方法  69-71
      2.1.1 人类PRS1 D52H突变体的构建及表达纯化  69
      2.1.2 D52H晶体生长数据收集及结构解析  69-70
      2.1.3 酶相对活性分析  70
      2.1.4 ITC实验检测ADP结合能力  70-71
    2.2 实验结果  71-78
      2.2.1 PRS1野生型和D52H突变体蛋白表达纯化  71
      2.2.2 D52H突变体的晶体生长  71-72
      2.2.3 D52H突变体的结构解析及模型质量评估  72-73
      2.2.4 D52H突变体的整体结构  73-74
      2.2.5 PRS1及D52H突变体催化活力比较  74-75
      2.2.6 D52H与PRS1结构上的差别  75-77
      2.2.7 PRS1 D52H突变体对抑制剂ADP结合能力的变化测试  77
      2.2.8 PRS1 D52H突变体对抑制剂ADP灵敏性测试  77-78
    2.3 实验结果讨论  78-79
  本篇小结  79-80
  参考文献  80-83
第三篇与PRS1相关蛋白的研究  83-109
  第1章 PRS1相关蛋白概述  83-93
    1.1 PRS1活性相关蛋白及其研究进展  83-89
      1.1.1 PRS1活性相关蛋白  83-86
      1.1.2 PRS1活性相关蛋白结构生物学研究进展  86-89
    1.2 PRS1其他相互作用相关蛋白研究进展  89-92
    1.3 本篇拟解决的问题  92-93
  第2章 PAP39是PRS1的激活因子研究  93-105
    2.1 实验材料与方法  93-98
      2.1.1 人类PAP39蛋白,PRS1无标签及P300 KIX结构域无标签的基因克隆及表达质粒的构建  93-96
      2.1.2 PAP39蛋白的表达及纯化  96-98
        2.1.2.1 PAP39蛋白的表达  96
        2.1.2.2 PAP39蛋白的纯化  96
        2.1.2.3 PAP39 与 PRS1 相互作用 Pul I down 实验  96-97
        2.1.2.4 PRS1与P300 KIX结构域相互作用Pu 11 down实验  97
        2.1.2.5 PAP39及PAP39-PRS1复合物酶动力学常数测定  97-98
    2.2 实验结果  98-102
      2.2.1 PAP39蛋白纯化及纯度鉴定  98
      2.2.2 PAP39与PRS1相互作用Pull down实验  98-99
      2.2.3 PRS1与p300 KIX结构域相互作用Pull down实验  99-100
      2.2.4 PAP39及PAP39-PRS1复合物酶动力学常数测定  100-101
      2.2.5 PAP39,PAP39-PRS1及PRS1-KIX结构域的晶体初筛  101
      2.2.6 PAP39,PAP39-PRS1及PAP39-PRS1用5nm金颗粒标记复合物负染电镜结构  101-102
    2.3 实验结果讨论  102-105
      2.3.1 PRS1相关蛋白及蛋白质复合物的纯化  102
      2.3.2 PRS1相关蛋白及蛋白质复合物的晶体初筛  102
      2.3.3 PAP39及PAP39-PRS1复合物酶动力学常数测定分析  102-105
  本篇小结  105-106
  参考文献  106-109
致谢  109-111
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  111

人类磷酸核糖焦磷酸合成酶PRS1及其相关蛋白的结构与功能研究

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