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电子自旋共振在蛋白质结构解析与功能分析中的应用

作　者: 吴凯棋
导　师: 田长麟
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 结构生物学
关键词: 电子自旋共振结构域 Rv0899蛋白 DAGK蛋白双电子电子共振 Ndil蛋白反铁磁量子化学计算
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

近些年,电子自旋共振(ESR)开始被广泛应用于结构生物学的研究,在蛋白质结构解析、蛋白质构象变化等等一系列重要的结构生物学问题上取得了令人瞩目的成功。结构域是蛋白质的基本构建模块,也是有特定功能蛋白质中独立进化的结构单元。某些蛋白质的结构域有明确规定的职能和行为,是各种细胞生命过程中的基石。基因组分析表明,超过70%的真核生物蛋白为多结构域蛋白。多结构域蛋白的模块化特性为其提供了稳定性以及新的合作功能。这些蛋白质的结构域之间通常由灵活的“连接器”连接。因此,确定这些结构域的相对取向和位置,将是理解结构域之间的相互作用以及多结构域蛋白功能机制的关键所在。通过对核磁共振和ESR获得的距离约束的结合,二结构域蛋白Rv0899的结构得到了解析,并且有潜力作为一种普遍性的方法用于多结构域蛋白的结构解析。利用双电子电子共振对两个定点标记的DAGK蛋白突变体进行了距离研究。对于已经获得的两个DAGK蛋白结构(晶体与液体核磁结构)加入自旋标记后计算得到的突变位点之间的距离,研究发现晶体结构的结果与实验值更加符合。ESR实验同样也能被用于磁性的研究。反铁磁是一种反平行电子对之间的短距离交换相互作用。铁磁性通常出现在含有过渡族金属元素的复合物中,这些过渡族金属元素最外层电子通常占据3d或者4f轨道。对于呼吸链中的复合物I,反铁磁性也表现在蛋白质中的铁-硫簇之间。Ndi1蛋白是一种二型复合物I酶,根据已解析的结构,Ndi1中没有任何的铁-硫簇存在,取而代之的是两个结合的泛醌分子。基于变温的ESR实验,本工作发现在Ndi1蛋白质中,也存在着反铁磁的相互作用。通过对实验数据进行van Vleck公式拟合,得到负的海森堡J耦合常数,此结果也进一步证明了反铁磁性质的存在。最后,通过对Ndi1蛋白质的结构的量子化学计算,本工作证明Ndi1中的反铁磁性来自于从黄素腺嘌呤二核苷酸到泛醌Ⅰ以及从泛醌Ⅰ到泛醌Ⅱ的电子传递过程,并且遵循通过空间相互作用的机制。对Ndi1蛋白一个突变的研究进一步确定,反铁磁来自电子传递而不是自旋偶极耦合作用。这是首次在生物分子中发现电子在基于p轨道的化合物中传递所导致的反铁磁效应,加深了人们对反铁磁效应的进一步认识,并且为把生物分子用于具有独特磁性质的材料的研发和制作带来了启发。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
第1章 ESR的理论和应用简介  11-27
  1.1 引言  11-12
  1.2 电子自旋共振现象  12-13
  1.3 蛋白质位点特异性突变和自旋标记  13-14
  1.4 利用SDSL-ESR方法研究蛋白质的动力学和结构性质  14-15
  1.5 利用ESR对蛋白质结构的距离测量  15-20
    1.5.1 双电子电子共振介绍  15-18
    1.5.2 DEER在结构生物学中的应用  18-20
  1.6 利用饱和转移ESR实验对不同自由基成份的研究  20-27
    1.6.1 饱和转移实验理论介绍  20-23
    1.6.2 饱和转移实验应用  23-27
第2章核磁共振结合ESR对多结构域蛋白Rv0899的研究  27-41
  2.1 引言  27-29
  2.2 实验材料和方法  29-32
    2.2.1 Rv0899蛋白质实验样品的表达、纯化和自旋标记  29-30
    2.2.2 Rv0899顺磁共振增强实验光谱的采集、谱峰归属和弛豫分析  30-31
    2.2.3 Rv0899蛋白质双电子电子共振实验样品的制备和实验过程  31-32
    2.2.4 利用NOE, PRE和DEER的距离约束对蛋白质进行结构计算  32
  2.3 结果与分析  32-39
    2.3.1 未引入顺磁共振增强和双电子电子共振距离约束时的结构  32-33
    2.3.2 对蛋白质主链的弛豫分析和X射线小角散射对蛋白刚性的研究  33-35
    2.3.3 引入顺磁共振增强和双电子电子共振距离约束后的结构  35-38
    2.3.4 距离相关性分析  38-39
  2.4 本章小结  39-41
第3章利用双电子电子共振实验对甘油二酯激酶DAGK晶体和液体核磁结构的验证  41-51
  3.1 引言  41-43
  3.2 实验材料与方法  43-44
    3.2.1 甘油二酯激酶DAGK蛋白实验样品的表达、纯化和自旋标记  43
    3.2.2 甘油二酯激酶DAGK质双电子电子共振实验和数据处理  43-44
  3.3 结果与分析  44-49
    3.3.1 DAGK蛋白样品的DEER光谱测量和距离结果  44-46
    3.3.2 MTSL分子整合入晶体结构和液体核磁结构的计算及自旋标记物之间的距离  46-49
    3.3.3 晶体结构与液体核磁结构与双电子电子共振实验结果的比较  49
  3.4 本章小结  49-51
第4章利用ESR对Ndi1蛋白电子传递过程的研究  51-71
  4.1 引言  51-54
  4.2 对Ndi1蛋白的饱和转移ESR实验  54-57
    4.2.1 实验准备和过程  54-57
  4.3 ESR对野生型Ndi1蛋白电子传递过程中的反铁磁现象的研究  57-63
    4.3.1 背景介绍  57-59
    4.3.2 样品制备  59
    4.3.3 对Ndi1(DDM)-NADH样品和Ndi1(DDM)-NADH-NADH样品中反铁磁现象的ESR低温实验  59-60
    4.3.4 对Ndi1(DDM)-NADH样品的超导量子干涉器实验  60-61
    4.3.5 实验结果  61-63
  4.4 经过自旋标记的GadC蛋白作为对照的研究  63-67
    4.4.1 简介  63-65
    4.4.2 GadC蛋白样品制备  65-66
    4.4.3 Gadc蛋白样品的温度依赖的ESR实验  66-67
  4.5 对Ndi1样品突变体的ESR低温实验研究  67-69
    4.5.1 简介  67
    4.5.2 Ndi1样品突变的样品制备  67-68
    4.5.3 Ndi1突变体的温度依赖的ESR实验  68
    4.5.4 低温实验结果  68-69
  4.6 本章小结  69-71
第5章利用量子化学对Ndi1蛋白电子传递过程的研究  71-79
  5.1 电子自旋密度的计算  71-74
    5.1.1 背景简介  71-72
    5.1.2 对Ndi1(DDM)-NADH Ndi1(DDM)-NADH-NADH电子传递过程中自旋密度的计算  72-73
    5.1.3 结论和讨论  73-74
  5.2 海森堡J耦合常数的计算  74-77
    5.2.1 理论背景简介  74-75
    5.2.2 对Ndi1(DDM)-NADH和Ndi1(DDM)-NADH-NADH样品中反铁磁现象中海森堡J耦合常数的计算以及海森堡J耦合常数和分子取向的关系  75-77
  5.3 本章小结  77-79
参考文献  79-87
附录1 van Vleck公式推导  87-89
附录2 自旋密度表和二面角定义  89-92
附录3 ONIOM方法介绍,CASSCF简介  92-105
致谢  105-107
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果  107

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