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NR2B介导的泛素-蛋白酶体系统成分的功能障碍对CREB活性的影响

作　者: 谢敏
导　师: 陈其才；廖晓梅
学　校: 华中师范大学
专　业: 动物学
关键词: 蛋白酶体 UCH-L1 NR2B Tau蛋白 CREB
分类号: R338
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)的主要生物学功能是降解细胞内聚集的或错误折叠的蛋白质以调节多种生物学过程,从而维持细胞的正常生理状态及功能。UPS中各个成分的功能障碍都会对生物体产生严重的负面影响,尤其是当这些异常作用发生在中枢神经系统中,不仅会引起记忆相关蛋白的表达缺失,还有可能会损伤突触可塑性和记忆功能的维持,从而造成记忆减退或神经变性。NMDA受体NR2B亚单位(N-methyl-D-aspartate receptor subtype2B, NR2B)在多种突触信号事件、蛋白质的相互作用以及人类神经退行性疾病中行使着极其重要的生物学功能。研究显示,UPS的许多底物都能够对NR2B亚单位的生物学功能产生影响,包括微管相关蛋白tau、突触蛋白、蛋白激酶以及蛋白磷酸酯酶等,因此,我们推测UPS可能通过其底物蛋白作用于NR2B亚单位,从而调节突触可塑性和学习记忆。本研究选取转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)为研究对象,分别从细胞、脑片和动物整体水平探索UPS成分功能障碍对记忆功能的调控及分子机制。作为转录因子,CREB在调节神经元蛋白的表达中发挥关键作用,且该调节作用对于突触可塑性和记忆的形成与维持至关重要。除了蛋白酶体,CREB的转录活性还受到NR2B亚单位介导的下游分子途径所调控,因此,探索泛素-蛋白酶体系统成分功能障碍对CREB活性调节的分子机制是揭示影响学习记忆功能的有效途径之一。1.蛋白酶体活性抑制诱导CREB去磷酸化(细胞系水平,N2a细胞)。研究结果表明蛋白酶体活性抑制可以通过两条途径下调CREB-Serl33位点的磷酸化水平,从而下调CREB的活性。(1)蛋白酶体活性抑制会引起tau蛋白的异常磷酸化和泛素化,且这些异常的tau蛋白能够通过下调NMDA受体NR2B亚单位在Tyr1472位点的磷酸化水平而调节NR2B亚单位正常的生理功能,最终导致CREB活性位点Ser133位点的磷酸化水平显著下降；(2)抑制蛋白酶体活性诱导激酶蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)和糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3p, GSK-3p)的活性发生改变,进而导致CREB-Ser133去磷酸化水平的增加。2.去泛素化酶泛素C末端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1, UCH-L1)的活性抑制参与海马脑片中CREB的去磷酸化调节(器官型海马脑片水平,C57BL/6小鼠海马脑片)。研究表明,UCH-L1会影响CREB的磷酸化水平及其转录活性,但其具体机制尚不清楚。为此,本研究用UCH-L1抑制剂LDN处理小鼠海马脑片以探索UCH-L1活性抑制对CREB活性的影响。实验结果表明,UCH-L1活性抑制导致海马脑片中CREB-Ser133的磷酸化水平显著下降。同时,UCH-L1抑制还引起tau蛋白的过度磷酸化、酪氨酸激酶Fyn活性下调、NR2B亚单位在Tyr1472位点的磷酸化水平下降以及突触蛋白PSD-95(postsynaptic density protein95)含量的增加。过度磷酸化的tau蛋白可通过干扰Fyn/NR2B/PSD-95复合体的形成,从而影响NR2B亚单位的生物活性,最终导致CREB活性的下调。除此之外,UCH-L1活性抑制引起的PKA活性下降也参与CREB的活性调节。3.蛋白酶体和UCH-L1功能障碍对小鼠空间记忆影响的分子机制(动物整体水平,APP/PS1双转基因小鼠)。APP/PS1双转基因小鼠是一种阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)模型小鼠,其主要病理特性是存在老年斑沉积且对神经细胞具有毒性作用。结果显示,APP/PS1小鼠具有明显的空间记忆缺陷。进一步检测发现APP/PS1小鼠海马和皮层部位的CREB的活性较对照组小鼠显著降低,且调节CREB活性的分子途径发生改变。一方面脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的水平显著下调与CREB活性下降密切相关；另一方面过度磷酸化的tau蛋白可能通过导致NR2B-Tyr1472位点磷酸化水平下降而影响NR2B亚单位的正常生理功能从而导致CREB的去磷酸化。另外,有研究显示,蛋白酶体和UCH-L1参与上述分子途径的活性调节。本研究发现,APP/PS1小鼠中蛋白酶体和UCH-L1的活性和表达水平都显著下调,表明APP/PS1小鼠空间学习记忆的缺陷可能是由泛素-蛋白酶体系统成分功能障碍导致的CREB活性下调引起的。因此,根据以上实验结果(1-3部分),本研究从proteasome and UCH-L1—abnormal tau protein—NR2B/CREB这一分子途径揭示了APP/PS1小鼠空间记忆障碍的分子机制。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-13
第一章 绪论  13-40
  1.1 转录因子CREB与学习记忆  14-17
    1.1.1 CREB的结构与功能调节  14-16
    1.1.2 CREB与学习记忆及其在神经退行性疾病中的作用  16-17
  1.2 微管相关蛋白tau与学习记忆  17-22
    1.2.1 Tau蛋白的结构与生理功能  17-20
    1.2.2 Tau病变对学习记忆功能的影响  20-22
  1.3 泛素-蛋白酶体系统与学习记忆  22-25
    1.3.1 泛素-蛋白酶体系统的组成及其对学习记忆的影响  22-24
    1.3.2 蛋白酶体抑制剂  24-25
  1.4 去泛素化酶  25-31
    1.4.1 泛素C末端水解酶L1的功能  27-28
    1.4.2 泛素C末端水解酶L1与神经退行性疾病  28-31
  1.5 NMDA受体  31-35
    1.5.1 NMDA受体的结构及功能  31-33
    1.5.2 NR2B亚单位的结构和功能  33-34
    1.5.3 NR2B亚单位的功能调节与学习记忆  34-35
  1.6 Fyn和PSD-95对NR2B亚单位的调节与学习记忆  35-38
    1.6.1 Fyn的结构和功能  35-36
    1.6.2 PSD-95的结构和功能  36-38
  1.7 本研究目的及意义  38-40
第二章 蛋白酶体抑制诱导CREB去磷酸化及其潜在机制  40-54
  2.1 引言  40-41
  2.2 材料和方法  41-44
    2.2.1 化学试剂及抗体  41-42
    2.2.2 细胞培养和药物处理  42
    2.2.3 蛋白酶体活性分析  42
    2.2.4 免疫印迹  42-43
    2.2.5 免疫沉淀  43
    2.2.6 数据分析  43-44
  2.3 结果  44-50
    2.3.1 MG132处理抑制蛋白酶体活性并增加多聚泛素化蛋白水平  44-45
    2.3.2 抑制蛋白酶体活性降低CREB的磷酸化水平  45-46
    2.3.3 蛋白酶体活性抑制降低NR2B亚单位Tyr1472位点的磷酸化水平  46-47
    2.3.4 蛋白酶体抑制导致tau蛋白的异常修饰  47-49
    2.3.5 蛋白酶体活性抑制诱导相关激酶活性改变  49-50
  2.4 讨论  50-52
  2.5 结论  52-54
第三章 抑制海马脑片UCH-L1的活性对CREB的影响  54-68
  3.1 引言  54-56
  3.2 材料与方法  56-57
    3.2.1 化学试剂及抗体  56
    3.2.2 器官型海马脑片培养和药物处理  56-57
    3.2.3 免疫印迹  57
    3.2.4 数据分析  57
  3.3 结果  57-64
    3.3.1 LDN处理对泛素化蛋白和UCH-L1水平的影响  57-58
    3.3.2 抑制UCH-L1的活性降低CREB的磷酸化水平  58-59
    3.3.3 抑制UCH-L1的活性诱导tau蛋白的过度磷酸化  59-61
    3.3.4 抑制UCH-L1的活性改变Fyn和NR2B亚单位的磷酸化水平  61-62
    3.3.5 抑制UCH-L1的活性改变突触蛋白的组成  62-63
    3.3.6 抑制UCH-L1的活性导致PKA的活性下调  63-64
  3.4 讨论  64-66
  3.5 结论  66-68
第四章 UCH-L1及蛋白酶体功能障碍对APP/PS1转基因小鼠空间记忆的影响  68-83
  4.1 引言  68-69
  4.2 材料与方法  69-71
    4.2.1 转基因小鼠的饲养和鉴定  69-70
    4.2.2 Morris水迷宫测试  70
    4.2.3 免疫印迹  70-71
    4.2.4 蛋白酶体活性分析  71
    4.2.5 UCH-L1水解酶活性分析  71
    4.2.6 数据分析  71
  4.3 结果  71-79
    4.3.1 PCR鉴定APP/PS1小鼠及野生型小鼠基因型  71-72
    4.3.2 APP/PS1小鼠空间学习记忆能力减退  72-74
    4.3.3 APP/PS1小鼠的CREB激活途径的活性下调  74-75
    4.3.4 APP/PS1小鼠的tau蛋白发生过度磷酸化  75-77
    4.3.5 APP/PS1小鼠的蛋白酶体和UCH-L1活性下调  77-78
    4.3.6 APP/PS1小鼠的蛋白酶体和UCH-L1的水平下调而泛素化蛋白水平上调  78-79
  4.4 讨论  79-82
  4.5 结论  82-83
第五章 结论与展望  83-85
  5.1 结论与创新点  83
  5.2 展望  83-85
参考文献  85-100
附录：专有名词的中英名称对照  100-102
攻读学位期间发表的学术论文  102-104
致谢  104-105

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生理学 > 神经生理学
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