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腺苷的细胞保护和细胞毒性作用

作　者: 李舒珏
导　师: 刘金保
学　校: 广州医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 腺苷 ATP 敏感性蛋白酶体抑制细胞保护细胞毒性
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的腺苷是一种遍布于机体细胞内的内源性核苷,它既是ATP的代谢产物,又是合成ATP的前体物质。机体氧含量正常时,腺苷保持低水平释放;而氧供给失衡时,腺苷释放量可大量增加。腺苷在临床上的应用十分广泛,它已经被用于治疗包括心律失常、急性心肌梗死、肺部炎症、神经源性疼痛、各种缺血再灌注损伤在内的多种疾病,其中腺苷在心脏疾病治疗中的应用最为成熟。目前人们对腺苷的研究多集中在腺苷激活细胞表面的腺苷受体之后产生的效应,我们将这一机制称为受体机制(间接作用)。腺苷受体分为A1,A2a,A2b,A3四个亚型,均为具有7个跨膜域的G-蛋白偶联蛋白家族,不同亚型的受体介导产生不同的生理和病理学效应。现有的绝大部分临床使用腺苷的理论基础都与腺苷受体的介导密不可分。腺苷还可以直接转运进入细胞后产生各种效应,我们称这一机制为非受体机制(直接作用)。目前为止有许多对腺苷双向性作用的研究和报道,但是其作用机理尚不清楚。本实验旨在从腺苷对细胞活力、增殖和死亡的影响以及腺苷对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡敏感性的影响两个方面探讨腺苷的双向作用及其机理。实验方法1.调控细胞内ATP水平1.1基础ATP水平的调控无糖/右旋葡萄糖培养基1.2下调细胞内ATP水平(1)寡霉素(oligomycin)抑制细胞的有氧氧化(2)2-脱氧葡萄糖(2-DG)抑制细胞的糖酵解(3)双嘧达莫(DP)抑制细胞向胞内转运腺苷2.细胞内ATP水平检测(1)HPLC(2)荧光素酶发光法ATP检测试剂盒3.细胞死亡检测(1)Annexin V-FITC-PI流式细胞术(2)荧光显微镜活细胞动态监测系统(3)Western blotting检测PARP蛋白的降解4.细胞活力和增殖检测(1)Alamar blue法(2)MTT法(3)细胞计数仪5.检测相关蛋白变化情况Western blotting实验结果1.腺苷的细胞保护和细胞毒性双向作用1.1 ATP前体物质腺苷增加各种细胞内ATP含量分别在右旋葡萄糖培养基和无糖培养基中培养各种细胞株,给予腺苷处理后,应用高效液相色谱法HPLC检测细胞内相对ATP浓度,结果显示Ade都能够在不同程度上提高细胞内ATP水平。1.2腺苷降低各种细胞的活力在右旋葡萄糖培养基中培养各种常见细胞株,给予不同浓度的腺苷(0.5- 5mM),作用72小时后,应用MTT法检测细胞活力,结果显示腺苷能够剂量依赖性降低细胞的活力。1.3腺苷对细胞死亡的影响1.3.1腺苷诱导Ana-1细胞凋亡正常培养条件下生长状态良好的Ana-1细胞,按对照、Ade0.5、1、2、4、8mM分组处理12小时,应用Annexin-V-FITC-PI流式细胞术检测,结果显示腺苷能够剂量依赖性诱导Ana-1细胞凋亡。1.3.2腺苷导致PARP蛋白的降解正常培养条件下生长状态良好的Ana-1细胞,按对照、Ade0.5、0.8、1、2、4mM分组处理6小时,应用western blotting方法检测PARP蛋白激活降解情况,结果显示腺苷能够剂量依赖性增加Ana-1内PARP蛋白的降解,诱导细胞凋亡。上述结果说明腺苷具有细胞毒性作用。1.4改变ATP水平对腺苷致细胞活力和增殖的影响1.4.1细胞内ATP低于生理浓度时腺苷增强细胞活力和增殖K562细胞培养于无糖、血清浓度1%的培养基中,细胞内ATP水平低于生理浓度,给予不同浓度的腺苷(0-8mM)处理48小时,应用alamarblue试剂检测,结果显示腺苷能明显增强k562细胞的活力和增殖。K562细胞培养于无糖培养基中,细胞内ATP低于生理浓度,给予不同浓度的腺苷(0.125-2mM),作用48上时,应用细胞计数仪进行细胞计数,结果显示腺苷能促进k562细胞增殖。1.4.2腺苷抑制k562细胞的活力和增殖K562细胞培养于无糖、血清浓度10%培养基中,或培养于含有2g/L右旋葡萄糖、血清浓度为1%或10%的培养基中,细胞内ATP接近或达到生理浓度,给予不同浓度的腺苷(0-8mM)48小时,应用Alamar blue试剂检测,结果显示腺苷能减弱k562细胞的活力和增殖。K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中,处于生理ATP浓度下,给予不同浓度的腺苷(0.125-2mM)作用48小时,应用细胞计数仪进行细胞计数,结果显示腺苷能抑制k562细胞增殖。上述结果说明以细胞内ATP生理浓度为界,腺苷双向影响细胞的活力和增殖:当细胞内ATP水平低于生理浓度时,腺苷产生细胞保护作用;当细胞处于生理ATP浓度下,腺苷表现为细胞毒性作用。1.5耗竭细胞内ATP对腺苷致细胞死亡的影响K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、Ade (2mM)、olig (0.5μg/ml)、Ade+olig分组处理18小时,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示寡霉素能够耗竭细胞内ATP而导致细胞大量凋亡,与对照组比较具有统计学差异,P<0.05;同时给予2mM腺苷能够明显逆转寡霉素导致的细胞死亡,与寡霉素组比较具有统计学差异,P<0.05。1.6双嘧达莫(DP)拮抗腺苷的细胞保护和细胞毒性作用1.6.1拮抗增殖抑制作用K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖、血清浓度10%的培养基中,按对照、Ade (2mM)、DP (5μM)和Ade +DP分组处理24小时,应用细胞计数仪进行细胞计数,结果显示腺苷能够抑制k562细胞的增殖,差异具有统计学意义,P<0.05;双嘧达莫能够部分拮抗腺苷的这一作用,与Ade组比较具有统计学差异,P<0.05。1.6.2拮抗细胞保护作用K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、Ade (2mM)、DP (5μM)、olig (0.5μg/ml)、Ade +olig组和olig +Ade +DP组处理18小时,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示寡霉素导致大量k562细胞死亡,同时给予腺苷能够提高细胞的存活率,差异具有统计学意义,P<0.05;双嘧达莫能够拮抗腺苷的细胞保护作用,与olig +Ade组比较差异具有统计学意义,P<0.05。1.6.3拮抗增加ATP的作用K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、Ade (2mM)、DP (5μM)、olig (0.5μg/ml)、Ade +olig组和olig +Ade +DP组处理3小时,应用荧光素酶发光法检测细胞内ATP水平,结果显示寡霉素使细胞内ATP含量减少,同时给予腺苷处理可将细胞内ATP水平恢复,而双嘧达莫几乎能够完全逆转腺苷所增加的ATP,使细胞内ATP回到与olig组同一水平。2.腺苷对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的敏感性的影响2.1腺苷提高蛋白酶体抑制剂(PI)诱导细胞死亡的敏感性2.1.1提高细胞死亡敏感性-流式细胞术K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中,按对照、MG132 (5μM)、Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (6h) +Ade (0.1、0.5、2mM)分组处理15h,应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测细胞凋亡情况,得如下结果:(1)低浓度的腺苷(0.1mM、0.5mM)可以剂量依赖性增加MG132诱导的k562细胞死亡。腺苷与MG132同时处理时可分别使细胞死亡率增加3.55%和8.35%,后者差异具有统计学意义,P<0.05;在MG132作用6小时之后给予腺苷处理分别使细胞死亡增加了11.45%、18.1%,差异具有统计学意义,P<0.05;同一浓度的腺苷,在6小时后给予所产生的增敏程度高于同时给予所产生的增敏程度,前者导致的细胞死亡率分别比后者增加了7.9%和9.75%。(2)在MG132作用6小时之后给予高浓度的腺苷(2mM)处理,能够增加MG132诱导产生的细胞死亡,细胞死亡率增加了23.2%,差异具有统计学意义,P<0.05;2mM腺苷与MG132同时处理时逆转MG132的细胞毒作用,使细胞死亡率降低了14.55%。2.1.2提高死亡敏感性-细胞形态学K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中,按对照、MG132 (5μM)、MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (6h) +Ade(0.1、0.5、2mM)分组处理后加入碘化吡啶(PI)染液,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测,共记录24小时。以15小时照片为例,得到如下结果:(1)低浓度的腺苷(0.1mM、0.5mM)可以增加MG132诱导的k562细胞死亡。腺苷与MG132同时处理时在形态学上表现为细胞死亡的轻微增加;MG132作用6小时之后给予腺苷处理则表现为形态学上细胞死亡明显加重,PI荧光增多增强。(2)在MG132作用6小时之后给予2mM腺苷处理,推动细胞形态在MG132组的基础上更进一步向死亡方向改变,明显提高了MG132诱导细胞死亡的敏感性;2mM腺苷与MG132同时处理时逆转MG132诱导细胞产生的形态学上死亡改变,形态学照片与对照组相似;(3)MG132作用6小时之后给予腺苷处理,腺苷剂量依赖性加重MG132诱导产生的细胞死亡。以上结果显示当细胞内ATP水平处于生理浓度下,相对低浓度腺苷处理能够提高蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的敏感性。2.2低能量状态下腺苷提高蛋白酶体抑制剂(PI)诱导细胞死亡的敏感性2.2.1腺苷死亡敏感性-流式细胞术K562细胞培养于无糖培养基中,处于低能量状态,按对照、MG132 (5μM)、Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)分组,处理12小时后,应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测细胞凋亡情况,得出如下结果:腺苷能够剂量依赖性增加MG132诱导产生的k562细胞死亡,各组间差异具有统计学意义,P<0.05。2.2.2提高死亡敏感性-细胞形态学K562细胞培养于无糖培养基中,处于低能量状态,按对照、MG132 (5μM)、Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade(0.1、0.5、2mM)分组处理后加入碘化吡啶(PI)染液,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测,共记录24小时。以第12小时相差通道照片和第24小时TRITC通道PI阳性细胞照片为例,得到如下结果:腺苷能够剂量依赖性地加重MG132诱导产生的形态学上细胞死亡,使PI荧光增多增强。上述结果表明,细胞内ATP水平低于生理浓度时,腺苷能够提高蛋白酶体抑制剂(PI)诱导细胞死亡的敏感性。2.3下调细胞内ATP拮抗腺苷对蛋白酶体抑制剂(PI)的增敏作用2.3.1寡霉素(oligomycin)拮抗增敏2.3.1.1 Oligomycin拮抗增敏作用-流式细胞术K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、MG132 (5μM)、Ade (2mM)、oligo (0.5μg/ml)、MG132 (0h) +Ade、MG132+oligo (0h) +Ade分组处理18小时,应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测,得到如下结果:腺苷能够明显加重MG132诱导的细胞死亡,而oligomycin能够完全逆转腺苷的这种增敏作用。K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、MG262 (1μM)、Ade (2mM)、oligo (0.5μg/ml)、MG262 (0h) +Ade、MG262 +oligo (0h) +Ade2mM分组处理18小时,应用AnnexinV-FITC-PI流式细胞术检测,得到如下结果:腺苷与MG262同时处理时能提升MG262组的细胞死亡率,而利用oligomycin下调细胞内ATP后可使细胞死亡率部分恢复,腺苷对MG262的增敏作用被部分拮抗。2.3.1.2 Oligomycin拮抗增敏作用-细胞形态学K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、MG132 (5μM)、MG262 (1μM)、Ade (2mM)、oligo (0.5μg/ml)、MG132 (0h) +Ade、MG262 (0h) +Ade、MG132 +oligo (0h) +Ade、MG262 +oligo (0h) +Ade处理后加入碘化吡啶(PI)染液,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测,共记录24小时。以第24小时的照片为例,得到如下结果:腺苷与MG132/MG262同时处理时均能导致形态学上细胞死亡明显加重,PI荧光增多增强,同时给予oligomycin下调细胞内ATP后,这种细胞死亡加重的现象可以被部分逆转,腺苷增多PI阳性细胞的作用被部分拮抗。2.3.2 2-脱氧葡萄糖(2-DG)拮抗增敏作用K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、MG132 (5μM)、Ade (2mM)、2-DG (5mM)、MG132 (0h) +Ade、MG132 +2-DG (0h) +Ade处理后加入碘化吡啶(PI)染液,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测,共记录24小时。以第12小时的照片为例,得到如下结果:MG132 +2-DG (0h) +Ade组的PI阳性细胞数目明显少于MG132 +2-DG (0h) +Ade组。2.3.3双嘧达莫(DP)拮抗增敏作用K562细胞培养于无糖培养基中,按对照、MG132 (5μM)、Ade (2mM)、DP (5μM)、MG132 (0h) +Ade、MG132 +DP5μM (0h) +Ade分组处理后加入碘化吡啶(PI)染液,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测,共记录24小时。以第15小时相差通道照片和第24小时TRITC通道PI阳性细胞照片照片为例,得到如下结果:腺苷与MG132同时处理时能导致形态学细胞死亡明显加重,PI荧光增多增强,同时给予DP处理时能逆转腺苷加重细胞死亡的作用,细胞形态和PI阳性照片与MG132组接近。前期实验结果已经证实寡霉素和2-脱氧葡萄糖分别可以下调培养于无糖培养基和右旋葡萄糖培养基中的细胞内的ATP水平,本实验也证实了双嘧达莫可以下调腺苷所增加的细胞内ATP,故各种下调细胞内ATP水平的手段均能够拮抗腺苷对蛋白酶体抑制剂的增敏作用的结果说明,腺苷对蛋白酶体抑制剂的增敏作用是在细胞内被代谢为ATP后产生的。2.4 Caspase途径介导了腺苷调控蛋白酶体敏感性2.4.1广谱Caspase抑制剂抑制增敏作用K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中,按对照、MG132 (5μM)、MG132 (6h) +Ade、Z-VAD (100μM)、MG132 +Z-VAD (6h) +Ade分组处理后加入碘化吡啶(PI)染液,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测,共记录24小时。以第15小时相差通道和TRITC通道PI阳性细胞照片为例,得到如下结果:Z-VAD100μM可以逆转MG132和腺苷共同作用时导致的大量细胞死亡。形态学上判断caspase抑制剂可以阻断MG132和腺苷联合产生的作用。2.4.2增敏作用与Caspase系统活化相关K562细胞培养于含有2g/L右旋葡萄糖的培养基中,按对照、MG132 (5μM)、Ade (0.2、1.0、2.0mM)、MG132 (0h) +Ade(0.2、1.0、2.0mM)分组处理12小时,应用western blotting法检测细胞凋亡通路上caspase家族相关蛋白(caspase8、9、3)和下游PARP蛋白以反映细胞凋亡情况,得到如下结果:(1)0.2mM和1.0mM的腺苷均能够剂量依赖性增多MG132引起的蛋白降解。(2)2mM腺苷使MG132引起的蛋白降解减少,产生与低浓度腺苷相反的作用。2.4.3不同能量状态下caspase系统及PARP改变的比较K562细胞分别培养于右旋葡萄糖培养基和无糖培养基中,分别按对照、PI、Ade (2mM)、PI (0h) +Ade、PI (6h) +Ade分组处理12小时,应用western blotting法检测细胞凋亡通路上Caspase家族相关蛋白(caspase8、9、3)和下游PARP蛋白的变化,得到如下结果:(1)右旋培养基培养细胞,胞内ATP处于生理浓度下,相对高浓度腺苷(2mM)与PI之间作用时间关系决定着caspase家族相关蛋白和PARP蛋白的变化:同时给予2mM腺苷和PI处理,前者能明显逆转后者导致的caspase家族相关蛋白和PARP蛋白的降解;给予PI6个小时之后才给予2mM腺苷,腺苷反而能够明显增加PI所导致的上述蛋白的降解。(2)无糖培养基培养细胞,胞内ATP低于生理浓度,2mM腺苷能够明显增加PI引起的caspase家族相关蛋白和PARP蛋白的变化,PI (6h) +Ade组出现的蛋白降解比PI (0h) +Ade更加严重。结论1.腺苷具有细胞保护和细胞毒性双向性作用,细胞内ATP浓度决定了腺苷的双向调节作用2.腺苷增加蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的敏感性,腺苷增敏作用与Caspase系统活化有关

全文目录

中文摘要  3-11
Abstract  11-21
前言  21-23
材料与方法  23-29
实验结果  29-37
讨论  37-40
结论  40-41
附图  41-52
参考文献  52-56
中英文对照词表  56-57
综述  57-70
  参考文献  65-70
致谢  70-71

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