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金针菇免疫调节蛋白（FIP-fve）表达特性及活性特征研究

作　者: 孔祥辉
导　师: 柳参奎
学　校: 东北林业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 金针菇免疫调节蛋白 重组蛋白 活性特征 酶联免疫试验 表达特性
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


免疫球蛋白(Immunoglobin, Ig)是代表机体体液免疫功能的一项重要指标,在体内承担免疫调节作用,开发的产品已被用于治疗免疫相关疾病。Ig具有由2条重链和2条轻链构成的“Y”型结构,顶端的可变区是Ig主要活性区域。真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein, FIP)是从真菌中分离的一类结构与Ig重链可变区结构极其相似而且具有免疫调节功能的小分子蛋白质。目前已发现7种FIPs,其中来源于金针菇的免疫调节蛋白(FIP from Flammulina velutipes, FIP-fve)经研究具有免疫调节作用,具有激活T淋巴细胞产生细胞因子、预防治疗哮喘、鼻炎、湿疹等过敏症和抑制癌细胞生长等生物活性。本研究通过RT-PCR方法获得FIP-fve cDNA序列,构建克隆载体pUC19-FIP-fve和表达载体pET30a (+)-FIP-fve,后者经酶切鉴定和测序后热激法转入大肠杆菌Transetta(DE3)并进行重组蛋白表达研究。确定了重组菌株高效可溶性表达条件为28℃,0.2mM IPTG诱导培养24h,表达率为30%以上。优化的菌体裂解方法为超声波法(200w,5s,30min)结合溶菌酶法,菌体裂解率达98%以上。采用镍离子亲和树脂建立柱式规模化纯化工艺获得单一蛋白,使His-FIP-fve产率达29.1mg/L,纯度97%以上,经研究冻干工艺获得了形态稳定、溶解性好、可用于注射的His-FIP-fve冻干粉针剂型。通过圆二色谱(CD)测定His-FIP-fve二级结构,结果表明其在大肠杆菌Transetta(DE3)中得到了正确折叠和有效表达,形成了具有低含量α-螺旋(15%)和高含量p-折叠(38%)的二级结构,并且具有少量β-转角结构,相应比例和天然蛋白相似,证明重组蛋白从二级结构上具备了有生物学活性的前提条件。研究了重组蛋白的体内生物学活性,通过ELISA实验研究了His-FIP-fve对小鼠血清中三种细胞因子(IL-2. IL-4和IFN-y)含量的影响。结果：低剂量组(5mg/kg)小鼠血清中IL-2和IFN-γ的含量最高,与空白对照组比较差异极显著(p<0.01)；各剂量组对小鼠血清中IL-4含量影响与空白对照组比较差异不显著(p>0.05),表明重组His-FIP-fve具有促进小鼠体内产生IL-2和IFN-y的活性,而对IL-4水平无显著影响。同时通过RT-PCR方法研究发现His-FIP-fve能够诱导细胞因子IFN-y和IL-2基因的表达。此外,通过其他原核表达载体表达了FIP-fve。构建了原核表达载体pGEX4t-1-FIP-fve并诱导表达,利用Gst亲和层析柱对表达产物进行了纯化,融合蛋白产率为5.8mg/L。并用凝血酶切割掉Gst标签,得到了单纯FIP-fve蛋白。该表达率较低,工艺较复杂,表达产物活性还需进一步研究。目前对该蛋白的研究主要集中在结构、功能和免疫调节机制等方面,对其表达特性及其表达调控机制的研究还未见报道,本研究立足于品种改良基础理论研究及蛋白表达特性研究,对金针菇8个品种进行栽培和液体发酵,获得了金针菇子实体和菌丝体样本；筛选内参基因,通过荧光定量PCR技术(Real-time PCR)了解不同品种、同一品种子实体菇盖,菇柄中段,茹柄基部以及液体发酵菌丝体中FIP-fve转录水平。结果：不同品种中FIP-fve基因转录水平不同,白色品种略高于黄色品种；菇柄中部高于菇柄基部,而在菇盖中的表达水平略低；幼嫩的菇蕾低于成熟子实体。同时,以纯化的His-FIP-fve为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备了效价高达1：128,000且特异性良好的兔抗His-FIP-fve多克隆抗体；通过免疫印迹法研究FIP-fve基因在不同品种、菇体发育不同阶段、不同部位及菌丝体中的蛋白表达情况。Western-blot实验结果：FIP-fve基因在白色品种表达量比黄色品种略高；菇柄中部和基部比菇盖略高；菌丝体中基本不表达成蛋白质；幼嫩的菇蕾中FIP-fve表达量低于成熟子实体。本研究优化了重组FIP-fve表达和纯化技术,获得重组His-FIP-fve大量表达和规模化生产工艺,通过动物体内活性试验研究了重组蛋白的活性特征,证实其具有和天然蛋白相类似的生物学活性,并研究了天然蛋白的表达特性。本研究为深入研究金针菇免疫调节蛋白的作用机制并促进重组蛋白在抗过敏、抗肿瘤和医药保健等方面的产品开发奠定研究基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-17
1 绪论  17-33
  1.1 引言  17
  1.2 FIPs与免疫球蛋白结构和活性的相似性  17-18
    1.2.1 免疫球蛋白的结构及其性质  18
    1.2.2 免疫球蛋白的生产及应用  18
  1.3 真菌免疫调节蛋白  18-24
    1.3.1 真菌免疫调节蛋白的生物学特征  19-20
    1.3.2 真菌免疫调节蛋白的结构特征  20-22
    1.3.3 真菌免疫调节蛋白生物活性  22-23
    1.3.4 真菌免疫调节蛋白基因克隆表达研究  23-24
  1.4 金针菇免疫调节蛋白(FIP-fve)  24-28
    1.4.1 金针菇免疫调节蛋白性质及生物活性  25-26
    1.4.2 金针菇免疫调节蛋白应用前景  26-28
  1.5 功能基因的表达系统  28-29
    1.5.1 Escherichia coli表达系统  28
    1.5.2 真核表达系统  28-29
  1.6 本课题研究目的意义  29-30
  1.7 研究内容与技术路线  30-33
    1.7.1 研究内容  30-32
    1.7.2 技术路线  32-33
2 金针菇免疫调节蛋白基因克隆His-FIP-fve表达研究  33-57
  2.1 实验材料与仪器  33-34
    2.1.1 材料  33-34
    2.1.2 仪器  34
  2.2 方法  34-44
    2.2.1 原核表达载体pET30-FIP-fve的构建  34-40
    2.2.2 重组蛋白His-FIP-fve表达优化  40-43
    2.2.3 重组融合蛋白His-FIP-fve纯化  43-44
  2.3 实验结果  44-54
    2.3.1 RNA模板制备  44-45
    2.3.2 质粒制备  45
    2.3.3 RT-PCR反应产物鉴定  45-46
    2.3.4 克隆载体pUC-FIP-fve鉴定与测序  46-47
    2.3.5 表达载体pET-FIP-fve双酶切鉴定及基因测序  47-48
    2.3.6 pET30-FIP-fve表达蛋白序列预测  48-49
    2.3.7 表达载体pET30-FIP-fve诱导表达  49
    2.3.8 表达载体pET30-FIP-fve原核表达产物纯化  49-53
    2.3.9 重组蛋白His-FIP-fve冻干工艺  53-54
  2.4 讨论  54-55
    2.4.1 基因重组技术  54
    2.4.2 重组蛋白可溶性表达  54-55
    2.4.3 菌体裂解技术  55
    2.4.4 重组蛋白纯化工艺  55
  2.5 小结  55-57
3 金针菇免疫调节蛋白Gst-FIP-fve表达研究  57-63
  3.1 材料与方法  57-59
    3.1.1 材料  57
    3.1.2 方法  57-59
  3.2 结果  59-61
    3.2.1 表达载体pGEX-4t-1-FIP-fve双酶切  59
    3.2.2 表达载体pGEX-4t-1-FlP-fve诱导表达Gst-融合蛋白  59-60
    3.2.3 重组Gst-融合蛋白纯化  60-61
    3.2.4 Gst-FIP-fve融合蛋白Gst标签去除  61
  3.3 讨论  61-62
  3.4 小结  62-63
4 重组His-FIP-fve二级结构、生物活性及机制初步研究  63-72
  4.1 实验材料  63
    4.1.1 试验动物及受试药物  63
    4.1.2 试剂和器材  63
  4.2 实验方法  63-65
    4.2.1 圆二色谱(CD)分析蛋白二级结构  63
    4.2.2 动物试验  63-64
    4.2.3 酶联免疫吸附试验  64
    4.2.4 重组蛋白诱导细胞因子基因表达的影响  64-65
  4.3 结果与分析  65-69
    4.3.1 His-FIP-fve二级结构分析  65-66
    4.3.2 重组His-FIP-fve对小鼠体内细胞因子含量的影响  66-68
    4.3.3 重组His-FIP-fve诱导细胞因子IL-2和IFN-γ基因表达的影响  68-69
  4.4 讨论  69-71
    4.4.1 重组蛋白His-FIP-fve二级结构重要性  69
    4.4.2 重组蛋白His-FIP-fve活性试验意义  69
    4.4.3 重组蛋白His-FIP-fve与天然蛋白活性的相似性  69-70
    4.4.4 过敏症疾病的预防和治疗  70
    4.4.5 未来研究重点  70-71
  4.5 小结  71-72
5 金针菇免疫调节蛋白基因表达特性研究  72-88
  5.1 材料  72-73
    5.1.1 菌种  72
    5.1.2 仪器、设备和试剂  72-73
  5.2 方法  73-78
    5.2.1 金针菇栽培  73
    5.2.2 金针菇菌丝体培养  73-74
    5.2.3 RNA提取  74
    5.2.4 金针菇内参基因序列筛选  74-75
    5.2.5 金针菇real-time PCR引物设计  75
    5.2.6 RT-PCR进行内参基因验证  75
    5.2.7 通过Real-time PCR研究FIP-fve表达特性  75-76
    5.2.8 通过RT-PCR研究FIP-fve表达特性  76
    5.2.9 His-FIP-fve多克隆抗体的制备  76
    5.2.10 蛋白提取  76
    5.2.11 蛋白免疫印迹试验(western-blot)  76-78
  5.3 结果  78-85
    5.3.1 金针菇不同品种栽培实验  78-79
    5.3.2 金针菇菌丝体培养  79
    5.3.3 金针菇总RNA提取  79-80
    5.3.4 RT-PCR筛选内参  80
    5.3.5 通过RT-PCR研究FIP-fve基因表达特性  80-81
    5.3.6 通过Real-time研究FIP-fve基因表达特性  81-82
    5.3.7 通过Western-blot研究FIP-fve表达特性  82-85
  5.4 讨论  85-86
    5.4.1 实时荧光定量PCR技术  85
    5.4.2 蛋白质印迹分析(Western-blot Analysis)  85-86
    5.4.3 关于内参  86
  5.5 小结  86-88
结论  88-89
参考文献  89-102
攻读学位期间发表的学术论文  102-103
致谢  103-104

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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