学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

六个小麦条锈病菌诱导的UniGene表达特性分析及TaLHY和TaNIT基因的克隆

作　者: 章毅
导　师: 张怀渝
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 小麦条锈病 SSH cDNA文库表达特性分析 TaLHY TaNIT
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 81次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

条锈病(Puccinia striiformis f.sp. tritic)是我国小麦的主要病害,特别是在我国西部地区由于适宜的发病条件,使条锈病近年来成为该小麦生态区最严重的病害。条锈菌生理小种变异快,条锈病抗源匮乏,可利用的抗性基因较少和条锈病原菌与寄主植物互作及植物抗病机理复杂,分子机理尚不清楚是限制了抗条锈病新品种的培育的原因。因此,在不断地发现新的抗性基因,快速培育具有持久抗性的突破性小麦新品种的同时,加强条锈病原菌与寄主识别及植物抗病的分子机理研究,克隆抗条锈病及其相关基因,是推动从根本上解决小麦条锈病威胁的关键。本研究在已经构建的小麦条锈菌条中32(CY32)诱导的抗条锈病品种川农19(CN19)的抑制差减杂交(SSH-cDNA)文库、并获得了大量差异表达ESTs的基础上,从中挑选出6个抗病相关的UniGene进行了表达特性分析,利用RACE技术和电子克隆技术对其中的2个基因进行全长克隆研究,以期从转录水平探讨条锈菌诱导的抗病反应分子机理和发掘抗条锈病相关基因。研究结果如下：1应用半定量RT-PCR技术对SSH-cDNA文库中筛选的6个抗病相关的UniGene在不同组织、病原菌诱导、激素处理和非生物胁迫条件下进行表达特性分析。6个UniGene已经在文库筛选过程中功能注释分别为VTC2, SAMDC,SHMT,半乳糖结合凝集素,JIP和LHY蛋白。①组织特异性表达分析结果表明,6个UniGene均能在拔节期的根、茎、叶及穗,和苗期的根和叶中表达,其中在穗或根中表达水平相对较高；②病原菌诱导表达结果表明,6个UniGene对条锈菌和白粉菌诱导的应答反应模式不同。CN19在接种CY32后,6个UniGene皆能在24-48小时内被诱导表达,积累到比较高的水平,而白粉病菌浸染后仅有半乳糖结合凝集素、VTC2和JIP基因在接种48小时后开始表达,在96小时达到高峰。推测SAMDC、SHMT及LHY基因是小麦条锈菌(CY32)诱导的高丰度表达基因；③激素诱导表达分析表明,6个UniGene皆对应答乙烯(Et)产生应答反应,而对SA和ABA产生不同的应答反应,推测CN19与CY32不亲和互作反应主要通过Et/JA途径调控,SA与ABA对防御反应中的部分基因具有调控作用；④JIP、植物凝集素基因和SHMT也参与冷、干旱和高盐非生物胁迫的应答反应。2TaLHY基因的克隆与生物信息学分析：从构建的SSH-cDNA文库中,利用RACE-PCR技术克隆了一个小麦MYB转录因子——TaLHY基因。其cDNA全长3085bp,其开放阅读框为1947bp,推测编码蛋白为648个氨基酸,分子量为70.3kDa,等电点为6.34；具有一个典型的植物MYB-DNA结合结构域,在结构域的C-端具有十分保守的氨基酸序列SH[AL]QKY[RF],与其他已公布的LHY家族成员具有较高的序列一致性,首次在小麦中报道了LHY蛋白,亚细胞定位分析TaLHY蛋白定位于细胞核,参与基因的转录调控、转录、信号转导功能。TaLHY基因能在条锈菌诱导48小时后表达水平提高,同时在Et处理1小时和4小时表达水平提高,证明了该基因参与小麦抗条锈病防御反应相关,同时,该基因参与防御反应可能是通过JA/Et途径调控。3目的基因TaNIT克隆与生物信息学分析：利用电子克隆结合RT-PCR技术,克隆了一个小麦腈水解酶基因——TaNIT基因。其cDNA全长1457bp,开放阅读框为1023bp,编码340个氨基酸,分子量约为36.3kDa,理论等电点pI为5.70；具有典型的NIT家族结构域,和保守的Glu-Lys-Cys催化三联体；亚细胞定位预测TaNIT蛋白是能与质膜之间松散结合的可溶性的细胞质蛋白；功能预测TaNIT作为一种裂解酶类,参与植物的能量代谢反应和植物的免疫反应的应答。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略词(ABBREVIATIONS)  8-11
第一章文献综述  11-26
  1.1 植物抗病反应的分子生物学研究进展  11-18
    1.1.1 植物的抗病机制  11-12
    1.1.2 植物防御反应信号分子和信号转导途径  12-16
    1.1.3 防卫基因  16-17
    1.1.4 活性氧在植物抗病反应中的作用  17-18
  1.2 MYB转录因子  18-20
    1.2.1 MYB转录因子的结构分类及作用  18
    1.2.2 MYB转录因子在植物防御中的研究进展  18-19
    1.2.3 小麦MYB转录因子的研究进展  19-20
  1.3 腈水解酶  20-21
  1.4 小麦条锈病研究概况  21-22
  1.5 全长基因的克隆方法  22-25
    1.5.1 电子克隆  22-23
    1.5.2 RACE  23-24
    1.5.3 cDNA文库筛选  24-25
  研究目的意义  25-26
第二章抗条锈病相关UNIGENES表达模式分析  26-41
  2.1 前言  26
  2.2 材料与方法  26-30
    2.2.1 实验材料  26-28
    2.2.2 材料处理  28
    2.2.3 小麦总RNA提取  28-29
    2.2.4 RT-PCR  29-30
  2.3 结果与分析  30-38
    2.3.1 总RNA的提取和鉴定  30-31
    2.3.2 六个UniGenes的组织特异性表达模式  31-32
    2.3.3 病原菌处理对六个UniGenes表达水平的影响  32-34
    2.3.4 植物激素对六个UniGenes表达水平的影响  34-36
    2.3.5 非生物胁迫对六个UniGenes表达水平的影响  36-38
  2.4 讨论  38-41
第三章小麦TALHY基因的克隆  41-54
  3.1 前言  41
  3.2 材料方法  41-44
    3.2.1 实验材料  41
    3.2.2 总RNA的提取及质量检测  41
    3.2.3 RACEcDNA模板合成  41-42
    3.2.4 RACE-PCR  42-43
    3.2.5 目标片段的纯化回收  43-44
  3.3 结果分析  44-52
    3.3.1 5'-RACE和3'-RACE扩增  44-47
    3.3.2 TaLHY氨基酸序列的生物信息学分析  47-52
      3.3.2.1 TaLHY氨基酸序列的同源多序列比对、保守结构域分析和进化树分析  47-49
      3.3.2.2 TaLHY蛋白的疏水性分析、磷酸化位点分析和亚细胞定位分析  49-51
      3.3.2.3 TaLHY蛋白的二级结构和三级结构分析  51-52
  3.4 讨论  52-54
第四章小麦腈水解酶(NITRILASE)基因TANIT的电子克隆及RT-PCR验证  54-63
  4.1 前言  54
  4.2 实验方法  54-55
    4.2.1 电子克隆小麦腈水解酶  54
    4.2.2 RT-PCR实验验证电子克隆的水解酶基因  54-55
  4.3 实验结果与分析  55-61
    4.3.1 小麦TaNIT的克隆  55-56
    4.3.2 TaNIT编码蛋白序列的生物信息学分析  56-61
      4.3.2.1 TaNIT的同源比对和进化树分析  56-59
      4.3.2.2 理化性质分析  59-60
      4.3.2.3 TaNIT跨膜区、亚细胞定位及功能预测分析  60-61
  4.4 讨论  61-63
第五章结论与展望  63-64
参考文献  64-72
致谢  72

六个小麦条锈病菌诱导的UniGene表达特性分析及TaLHY和TaNIT基因的克隆

内容摘要

全文目录

相似论文