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灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因的克隆及其表达和功能特性的研究

作　者: 欧阳翔
导　师: 赵明文
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 灵芝三萜 HMG-CoA合酶克隆启动子表达特性功能特性
分类号: S567.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

灵芝三萜类化合物是灵芝的重要药用成分,具有多种重要的生理功能,灵芝中三萜含量的高低已经成为灵芝质量高低的重要指标。灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因(GlHMGS)作为甲羟戊酸途径中的第一个催化酶,催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA,对于灵芝三萜的合成起着十分重要的作用。根据已发表的其它物种HMGS氨基酸序列的保守区,设计简并引物,以灵芝基因组DNA和反转录的原基cDNA为模板,经PCR扩增,获得了两个大小分别为600、350bp的灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因特异的DNA和cDNA片段。利用获得的GIHMGS基因特异片段,根据SEFA-PCR的原理,设计特异性引物,以灵芝基因组DNA为模板扩增得到GIHMGS基因的5′端序列；以灵芝原基cDNA作为模板,通过3’RACE技术获得GIHMGS基因的3′端cDNA序列；进而根据获得的5′端和3′端序列信息设计引物,分别以灵芝总基因组DNA和原基cDNA为模板,得到GIHMGS基因的全长DNA和cDNA序列。结果表明：该基因DNA全长为1870 bp,其中ORF为1413 bp,编码471个氨基酸,推测的分子量为51.14 kDa。通过比对获得的DNA和cDNA序列,发现GlHMGS由5个外显子和4个内含子构成；与NCBI数据库中HMGS的蛋白序列比对发现,GIHMGS与解脂耶罗威亚酵母的HMGS表现出最高的同源性(51%)。进化树分析也表明GIHMGS与真菌亲缘关系最近,符合灵芝的物种分类地位。将获得的GIHMGS基因转入HMGS缺陷的二倍体酿酒酵母菌株YSC1021,经产孢培养和单倍体筛选获得HMGS缺陷的单倍体转化子,发现在有GIHMGS表达的单倍体酵母转化子中,其HMGS缺陷的表型可以得到互补,从而证实了所得GIHMGS的功能。另外,根据GIHMGS基因DNA序列设计引物,以灵芝基因组DNA为模板,利用SEFA-PCR技术扩增GIHMGS基因上游启动子序列,该序列长约1561 bp,用Softberry等软件对启动子序列进行分析,发现GIHMGS基因启动子中包含有明显的TATA-box和CAAT-box,并发现了多个与甾醇、激素和环境压力等调节相关的顺式作用元件。同时,利用Real Time RT-PCR技术,检测了灵芝不同发育阶段中GlHMGS在mRNA水平的表达差异。结果证明,GlHMGS mRNA的转录水平以灵芝发育初期的菌丝体阶段最高,而在三萜含量最高的原基时期很低,说明GlHMGS可能同时受到了发育调节和甾醇的反馈抑制。对茉莉酸甲酯诱导条件下GlHMGS mRNA转录水平的检测也发现：茉莉酸甲酯对GlHMGS的影响十分明显。其中以茉莉酸甲酯作用浓度为100μM处理5天时对GlHMGS的诱导效果最显著；同时,对GlHMGS启动子的分析发现其上存在潜在的茉莉酸甲酯响应元件。这些结果表明,GlHMGS可能同时受多种生理途径的综合调节,并在灵芝三萜生物合成途径中起着重要的作用。本实验还研究了灵芝漆酶的同工酶基因Laccase受金属Cu2+诱导表达的转录特性,并通过对其5′端转录调控区的克隆和结构分析,初步探讨了其结构与漆酶基因转录表达的内在关系；进而在此基础上构建了一个Cu2+诱导型表达载体系统；以期通过诱导型超量表达分析,进一步揭示GlHMGS在灵芝三萜类化合物途径中的作用。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-23
  一、灵芝的研究概况  10-14
    1 灵芝的化学成分  10-13
    2 灵芝分子生物学研究  13-14
  二、羟甲基戊二酰辅酶A合酶的研究进展  14-21
    1 萜烯类化合物生物合成途径  14-16
    2 羟甲基戊二酰辅酶A合酶  16-21
  三、选题依据  21-23
第二章灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)基因的克隆  23-49
  引言  23
  第一节灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因特异片段的克隆  23-30
    1 实验材料  23-24
    2 实验方法  24-29
    3 结果与讨论  29-30
  第二节灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因5′和3′端的获得  30-35
    1 实验材料  30
    2 实验方法  30-34
    3 结果与讨论  34-35
  第三节灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因基因DNA和cDNA全长的获得及序列分析  35-42
    1 实验材料  35-36
    2 实验方法  36-37
    3 结果与讨论  37-42
  第四节灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因的功能验证  42-49
    1 实验材料  42-43
    2 实验方法  43-47
    3 结果与讨论  47-49
第三章灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因启动子的克隆及其序列分析  49-55
  1 实验材料  49
  2 实验方法  49-55
    3 结果与讨论  51-55
第四章灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因表达特性分析  55-61
  第一节 Real Time-PCR检测灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因在不同发育阶段的表达特性  55-58
    1 实验材料  55-56
    2 实验方法  56-57
    3 结果与分析  57-58
  第二节茉莉酸甲酯对灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因MRNA表达水平的影响  58-61
    1 实验材料  59
    2 实验方法  59
    3 结果与分析  59-61
第五章灵芝诱导型表达载体的构建和灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因的超量表达分析  61-76
  第一节灵芝漆酶基因(LACCASE)的CU~(2+)诱导特性分析  61-64
    1 实验材料  61-62
    2 实验方法  62-63
    3 结果与讨论  63-64
  第二节灵芝漆酶基因启动子的克隆  64-69
    1 实验材料  64-65
    2 实验方法  65-67
    3 结果与讨论  67-69
  第三节灵芝中诱导型表达载体的构建及灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因的超量表达分析  69-76
    1 实验材料  69
    2 实验方法  69-73
    3 结果与讨论  73-76
参考文献  76-86
全文总结  86-88
附录  88-90
致谢  90-92
攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  92

灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因的克隆及其表达和功能特性的研究

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