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SWI/SNF染色体重塑复合物在人胚胎干细胞中的功能研究

作　者: 郑东燕
导　师: 王媛
学　校: 华东师范大学
专　业: 生物医学
关键词: 功能分化多能性自我更新胚胎干细胞染色体重塑复合物
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

ATP依赖的SWI/SNF染色体重塑复合物是表观遗传学修饰中一个重要的家族,复合物中的Brgl或Brm具有ATP酶活性,它们利用水解ATP释放的能量,来改变染色体的结构从而改变转录调控因子对染色质的可接近性以实现对基因的表达调控。哺乳动物的SWI/SNF复合物对于早期胚胎全能性和多能性细胞的形成是必须的。以往,关于SWI/SNF复合物与胚胎干细胞多能性关系的研究大都是在鼠胚胎干细胞中进行,尚无在人胚胎干细胞中的报道。而我们的基因芯片分析结果显示,在人胚胎干细胞中用RNA干扰技术使BRG1低表达导致的基因表达谱的改变与小鼠胚胎干细胞的不尽相同。另外,我们的Western Blots及实时定量RT-PCR结果显示,在人胚胎干细胞的SWI/SNF复合物以BRG1为主要作用。因此,为了探究SWI/SNF复合物对人胚胎干细胞自我更新及分化的影响,我们建立了稳定干扰BRG1表达的人胚胎干细胞。结果发现,在BRG1低表达7-10天时,人胚胎干细胞已出现了明显的分化表型,流式细胞分析和碱性磷酸酶染色实验也证实了BRG1的低表达确实引起了人胚胎干细胞的分化。同时,实时荧光定量RT-PCR分析显示,BRG1的基因表达被持续降低后,会导致人胚胎干细胞向三个胚层及滋养外胚层细胞不同程度的分化。尽管染色质免疫共沉淀的结果表明BRG1直接作用于多能性相关基因Oct4,但多能性相关基因Oct4和Nanog表达水平的变化在BRG1knockdown的初期并不显著。另外,基因芯片分析、实时荧光定量RT-PCR和染色质免疫共沉淀结果亦表明,在人胚胎干细胞中,BRG1影响和调控细胞周期调控因子的表达,但是流式分析结果尚没有看到BRG1对人胚胎干细胞细胞周期的显著影响,进一步的研究将结合细胞周期阻滞剂及DNA损伤等模型探讨BRG1对细胞周期的调节。综上所述,SWI/SNF染色体重塑复合物对人胚胎干细胞的细胞周期及生长有广泛的影响,是维持干细胞自我更新和多能性必需的。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第一章综述  12-31
  第一节 SWI/SNF家族简介  12-15
  第二节 SWI/SNF与基因的表达调控  15-17
  第三节 SWI/SNF复合物与胚胎发育  17-18
  第四节 SWI/SNF复合物与胚胎干细胞  18-31
第二章实验材料和方法  31-71
  第一节实验材料  31-40
    1. 细胞株  31
    2. 细胞培养  31
    3. 质粒和shRNA序列  31
    4. 引物序列  31-38
    5. 实验试剂和抗体  38
    6. 实验仪器  38-40
  第二节实验方法  40-71
    1. 质粒的小量抽提技术  40-41
    2. 质粒的大量抽提技术  41-42
    3. Western-blot技术  42-56
    4. 逆转录PCR技术和实时荧光定量PCR技术  56-61
    5. 稳转细胞株的建立与筛选  61-63
    6. 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)技术  63-68
    7. 流式细胞技术(Fluorescence Activating Cell Sorter)  68-69
    8. 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色  69-70
    9. 基因芯片(Microarray)  70-71
第三章实验结果与分析  71-85
  第一节人和鼠胚胎干细胞基因表达差异比较  71-77
  第二节 SNF/SNF复合物与人胚胎干细胞的自我更新  77-81
  第三节 SWI/SNF复合物与胚胎干细胞的分化  81-82
  第四节人胚胎干细胞中SWI/SNF复合物与细胞周期  82-85
第四章总结与讨论  85-87
附录  87-88
参考文献  88-94
感谢  94

SWI/SNF染色体重塑复合物在人胚胎干细胞中的功能研究

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