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灯盏花和三七提取物对Trx、CDK5和HSP70表达影响

作　者: 齐磊
导　师: 白洁
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 脑缺血硫氧还蛋白热休克蛋白70 细胞周期依赖蛋白激酶5
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脑中风是常见脑血管病之一,是导致人类残疾和死亡的主要原因。中风主要有两种类型：缺血和出血。缺血中风占脑中风的大约85%。目前,缺血性中风的主要治疗方法有清除自由基、扩血管、活血化瘀等治疗。重组纤溶酶原激活物(recombinant tissue plasminogen activator, rtPA)是美国食品及药物管理局批准的唯一用来治疗脑缺血的药物,但只适用于很小的一部分脑缺血的病人,而且治愈率低。目前缺血的治疗选择非常有限,寻找新的治疗方法变得至关重要。传统中药由于其相对较长的治疗时间窗,药作用平缓、副作用少,并且价格便宜,因此,在传统中药中寻找更有效的治疗脑缺血的药物是目前中医药研究的一个热点。脑缺血后缺血中心的脑细胞会发生死亡,然而在缺血半暗带中的许多神经细胞都有可能存活,所以在脑缺血发生后,如果得到有效的治疗,这些区域有潜在的恢复可能。脑缺血后发生了氧化应激,炎症反应,通过对这些反应的控制有利于挽救缺血半暗带的神经细胞。灯盏花和三七是我国的传统中药,灯盏花能清除活性氧自由基,抑制缺血引起的神经元的凋亡,灯盏花还具有抑制血小板聚集,抑制体内凝血功能和促进纤溶活性,从而抑制血栓形成的功效,以及增加局部脑血流量,改善脑血循环的作用,三七也具有抗氧化应激的作用,能减少缺血后脑组织的梗死,减少缺血对神经细胞造成的损伤,改善神经功能障碍。硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一个12 kDa的小分子量蛋白,Trx有一个高度保守的-Cys-Gly-Pro-Cys-活性位点,具有多种生物学功能,它和NADPH及硫氧还蛋白还原酶一起组成硫氧还蛋白还原系统,调节细胞内的氧化还原平衡,调节蛋白质的折叠和转录因子的活性。同时,Trx还具有抗凋亡,促进细胞生长和血管再生及神经生长因子样的作用。热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)是一个分子量为70 kDa的热休克蛋白家族,它是一个最广泛的热休克蛋白家族,HSP70能协助蛋白质的折叠和翻转,降低蛋白质的积聚,保持线粒体的生理功能,抑制凋亡、坏死和炎症反应等。细胞周期依赖蛋白激酶5 (Cyclin-dependent kinase 5, CDK5)是丝氨酸／苏氨酸激酶家族的一员,与该家族其他成员不同的是,CDK5在细胞周期的调控中并不起作用。有研究表明CDK5能促进神经元的存活。同时,CDK5还参与了神经元的迁移以及突触的形成和树突的延伸。本课题将使用灯盏花及三七的提取物,研究他们在PC12细胞株小鼠体内诱导Trx, HSP70以及CDK5的表达,实验结果发现：在PC12细胞中灯盏花乙素衍生物DY-09001、三七总皂苷SQ-09004和三七总皂苷成分之一SQ-09003都能诱导Trx的表达；SQ-09003和SQ-09004通过ERK和PI3K/Akt信号通路诱导了Trx的表达,DY-09001通过PI3K/Akt信号通路诱导了Trx的表达,但不通过ERK信号通路；三种药物对CDK5和HSP70的表达没有影响。C57BL/6小鼠分别注射三种药物后,我们发现：(1)DY-09001在大脑皮层中增加了Trx和HSP70的表达,但对CDK5的表达无影响；在海马组织中,低浓度(20 mg/kg和40 mg/kg)对CDK5和HSP70的表达均无影响,而在高浓度(80 mg/kg)时,降低了Trx的表达。(2)SQ-09003在大脑皮层中,SQ-09003增加了Trx和HSP70的表达,但对CDK5的表达无影响；在海马组织中,低浓度(20mg/kg和40 mg/kg)对Trx、CDK5和HSP70的表达均无影响,而在高浓度(80 mg/kg)时,降低了Trx的表达。(3)SQ-09004在大脑皮层中对Trx、CDK5和HSP70的表达均无影响；在海马组织中,高浓度(80 mg/kg)能降低CDK5的表达,但对Trx和HSP70的表达无影响。此外,为了进一步在动物体内验证各成分的对脑缺血作用,建立脑缺血模型是非常重要的一步,本实验成功建立了大脑中动脉缺血的模型。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-10
缩略语索引  10-11
第一章绪论  11-32
  1.1 脑缺血  11-15
    1.1.1 脑缺血研究现状  11
    1.1.2 脑缺血后发生细胞凋亡  11-14
    1.1.3 脑缺血与活性氧自由基  14-15
    1.1.4 脑缺血与炎症  15
  1.2 灯盏花和三七  15-18
    1.2.1 灯盏花  15-16
    1.2.2 三七  16-18
  1.3. 硫氧还蛋白  18-25
    1.3.1 硫氧还蛋白简介  18
    1.3.2 硫氧还蛋白的结构  18-19
    1.3.3 硫氧还蛋白结合蛋白  19
    1.3.4 硫氧还蛋白还原系统  19-20
    1.3.5 硫氧还蛋白的生物学功能  20-25
  1.4 热休克蛋白70  25-28
    1.4.1 热休克蛋白简介  25
    1.4.2 HSP70的结构特点  25-26
    1.4.3 HSP70的辅因子  26-27
    1.4.4 HSP70与神经疾病  27-28
  1.5 CDK5  28-31
    1.5.1 CDK5简介  28
    1.5.2 CDK5与细胞周期调节  28-29
    1.5.3 CDK5和神经元迁移  29
    1.5.4 CDK5与树突延伸和突触形成  29-30
    1.5.5 CDK5与神经元的生存和死亡  30-31
  1.6 本论文研究意义  31-32
第二章三种药物对PC12细胞中目的蛋白表达影响  32-45
  2.1. 实验方案  32
  2.2 实验材料及方法  32-40
    2.2.1 PC12细胞  32-33
    2.2.2 实验样品  33
    2.2.3 实验试剂  33-34
    2.2.4 实验仪器设备  34-35
    2.2.5 试剂配方  35-37
    2.2.6 实验方法  37-40
  2.3 实验结果  40-42
    2.3.1 三种药物对PC12细胞内Trx、CDK5和HSP70表达的影响  40-41
    2.3.2 三种药物诱导Trx表达的途径  41-42
  2.4. 小结  42-45
第三章小鼠体内三种药物最佳剂量的确定  45-50
  3.1. 实验方案  45-46
  3.2 实验材料  46
    3.2.1. 实验设备  46
    3.2.2 C57BL/6小鼠  46
  3.3. 实验结果  46-49
    3.3.1 DY-09001对C57BL/6小鼠皮层和海马区Trx、CDK5和HSP70表达的影响  46-47
    3.3.2 SQ-09003对C57BL/6小鼠皮层和海马区Trx、CDK5和HSP70表达的影响  47-48
    3.3.3 SQ-09004对C57BL/6小鼠皮层和海马区Trx、CDK5和HSP70表达的影响  48-49
  3.4 小结  49-50
第四章小鼠脑缺血模型的构建  50-55
  4.1 实验材料  50
  4.2. 大脑中动脉栓塞脑缺血模型的构建  50-52
    4.2.1 实验条件  50
    4.2.2 小鼠颈动脉系解剖示意图  50-51
    4.2.3 手术过程  51
    4.2.4 MCAO脑缺血模型评分标准  51-52
    4.2.5 TTC染色  52
  4.3. 小结  52-55
第五章全文总结  55-56
  5.1 PC12细胞中,药物对目的蛋白表达的影响  55
  5.2 三种药物诱导Trx表达的信号通路  55
  5.3 确定动物体三种药物使用的合适浓度  55
  5.4 建MCAO脑缺血模型  55-56
致谢  56-57
参考文献  57-74
附录A 攻读硕士期间发表论文目录  74

灯盏花和三七提取物对Trx、CDK5和HSP70表达影响

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