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过氧化物酶体增殖激活受体参与调控小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

作　者: 张宇宇
导　师: 楼宜嘉
学　校: 浙江大学
专　业: 药理学
关键词: 胚胎干细胞胰岛素分泌细胞定向分化胰岛素分泌线粒体发生膜电位维持过氧化物酶体增殖激活受体
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胚胎干(embryonic stem, ES)细胞来源于胚泡内细胞群,具有自我更新和多分化潜能的全能干细胞,在体外合适环境下可被诱导分化成机体多种细胞,如神经细胞、心肌细胞、肝脏细胞等。在体外其命运主要由自身固有调控和细胞外微环境双重决定。晚期糖尿病细胞移植治疗目前尚在试验阶段,获得具有insulin分泌功能的胰岛B样细胞,可望促进研究进程。ES细胞自发分化产生的胰岛素分泌(insulin-producing, IP)细胞极少,调控微环境可望促进其分化作用。过氧化物酶体增殖因子活化受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)是核受体超家族成员,包括0c、p、1,三个亚型,在控制脂肪的贮藏和能量分解代谢方面起着重要作用。文献报道,胰岛B细胞的胰岛素分泌作用与ATP产生密切相关,线粒体是产生ATP的重要细胞器,而PPARs与线粒体这一能量发生系统关系密切。本课题组前期研究发现,PPARs不同亚型在Es细胞分化为心肌、肝脏等过程中扮演重要角色,尤其是来自内胚层的肝细胞定向分化与PPARβ受体激动密切相关。但迄今未知同样来自内胚层的IP细胞分化过程中,PPARs各亚型扮演着何种角色。本实验通过三步法诱导小鼠ES细胞定向分化为IP细胞,探索分化过程中线粒体发生(mitochondriogenesis)和线粒体膜电位(mitochondria membrane potential,Δψm)变化情况,PPARs各亚型表达情况及其作用,为发现IP细胞分化过程能量发生特征,促胰岛D样细胞再生药物作用新靶点探索和再生医学细胞移植治疗细胞来源等提供实验依据。

全文目录

致谢  4-5
本课题受以下基金资助  5-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
论文创新点  8-12
1 引言  12-14
2 试剂与器材  14-17
  2.1 实验动物及细胞株  14
  2.2 主要试剂  14-15
  2.3 实验仪器和器材  15
  2.4 小鼠ES细胞定向分化为IP细胞用溶液  15-17
    2.4.1 细胞培养液  15-16
    2.4.2 其他溶液  16-17
3 实验方法  17-25
  3.1 小鼠ES细胞体外定向分化为IP细胞分化步骤  17-19
    3.1.1 MEF细胞培养  17
    3.1.2 饲养层制备  17
    3.1.3 ES细胞的支持培养和传代  17-18
    3.1.4 ES细胞定向分化为IP细胞  18-19
  3.2 分化细胞鉴定  19-20
    3.2.1 细胞形态光镜观察  19
    3.2.2 双硫腙(dithizone,DTZ)染色法  19-20
  3.3 免疫细胞化学法检测胰岛β细胞相关蛋白表达  20
  3.4 流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测阳性细胞分化率  20-21
  3.5 酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养液中胰岛素分泌量  21
  3.6 Western-blot法检测蛋白表达  21-22
  3.7 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测基因表达  22-24
  3.8 JC.1染色检测线粒体发生及膜电位维持  24
  3.9 统计处理  24-25
4 小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞模型确立  25-34
  4.1 实验结果  25-31
    4.1.1 小鼠ES细胞培养和分化形态学特征  25-26
      4.1.1.1 小鼠ES细胞  25
      4.1.1.2 EBs的形成  25
      4.1.1.3 自发分化形成的各胚层细胞  25
      4.1.1.4 分化终点细胞  25-26
    4.1.2 DTZ染色法鉴定ES细胞衍生5+28d分化终点细胞  26-27
    4.1.3 免疫荧光法鉴定ES细胞衍生5+28d分化终点细胞  27-28
    4.1.4 RT-PCR检测ES细胞分化过程中胰岛β细胞相关基因表达  28-29
    4.1.5 FCM检测ES细胞衍生胰岛素阳性细胞分化率  29
    4.1.6 ELISA法检测ES细胞分化终点细胞对葡萄糖敏感的胰岛素分泌量  29-31
  4.2 讨论  31-33
  4.3 结论  33-34
5 小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞过程中线粒体发生及PPARs的调控  34-43
  5.1 实验结果  34-40
    5.1.1 JC-1染色法检测分化过程中细胞线粒体△Ψm变化  34-36
    5.1.2 FCM检测分化终点细胞PPARs和insulin共表达率  36
    5.1.3 Western-blot法检测分化过程中PPARs各亚型相关蛋白表达  36-37
    5.1.4 PPARs激动剂和拮抗剂对分化早期和终点细胞△Ψm影响  37-38
    5.1.5 PPARs激动剂和拮抗剂对分化终点insulin阳性细胞率的影响  38-40
  5.2 讨论  40-42
  5.3 结论  42-43
6 附,PPARs各亚型在大鼠原代肝细胞中的表达情况  43-47
  6.1 研究目的  43
  6.2 实验材料  43
  6.3 液体配置  43-44
  6.4 操作步骤  44
  6.5 实验结果  44-46
  6.6 结论  46-47
7 参考文献  47-51
综述  51-65
  参考文献  60-65
作者简历及在学期间所取得的科研成果  65

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