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MEF和hLEF对小鼠ES细胞支持作用的比较性研究

作　者: 韩晓芳
导　师: 熊承良
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: 丝裂霉素C MEF饲养胚胎干细胞 MEF饲养层碱性磷酸酶 OCT-4 丝裂霉素C浓度饲养层 OCT4
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

第一部分MEF饲养层对小鼠胚胎干细胞（MES）的支持效果实验一小鼠成纤维细胞（MEF）的制备目的制作原代小鼠成纤维细胞（MEF），为小鼠胚胎干细胞（MES）饲养层做准备。方法将雌、雄昆明小鼠2：1合笼，取妊娠12~18d孕鼠，无菌取出胎鼠。去除胎鼠头尾四肢内脏，PBS清洗数次后，剪碎组织，胰蛋白酶消化细胞，进行原代细胞培养，并按常规方法传代、冻存。结果前三代小鼠成纤维细胞中杂细胞（非成纤维细胞）较多，细胞形态多样。随着传代次数的增加，细胞形态逐渐一致,细胞连接成片，细胞之间连接紧密、界限不清。大部分细胞的胞质有2~3个突起，呈梭形，少数为圆形或不规则性。细胞胞体中间部分即细胞核所在的部位稍稍隆起，细胞轮廓清晰、立体感较强。细胞质内颗粒很少，细胞较为透明。实验二MEF饲养层的制备目的制备MEF饲养层，为小鼠ES的培养做准备。方法取对数期生长期的MEF，用终浓度10μg/ml丝裂霉素C处理2h。PBS充分洗涤五次。消化细胞调整浓度为0.5x106个/ml,均匀种植到经过0.1%明胶包被的6孔板里。结果MEF饲养层细胞经过丝裂霉素C处理以后,种植到6孔板，2~3d后细胞融合成片，连接紧密单层生长。倒置显微镜下观察，与药物作用之前相比，MEF细胞数量略有减少，细胞形态没有发生明显的变化，细胞大多呈梭形，大小一致，排列规则、边界清楚。选择适当的丝裂霉素C浓度和作用时间对饲养层的制作很关键。用浓度为10μg/ml的丝裂霉素C对MEF处理2h，饲养层细胞不再增殖同时保持良好的生存状态。MEF细胞经过丝裂霉素C处理以后，1~2w左右会衰退死亡。实验三小鼠ES细胞在MEF饲养层上的生长特征目的观察小鼠胚胎干细胞（ES）在MEF饲养层上的生长情况。方法选取的丝裂霉素C处理过的原代小鼠成纤维细胞（MEF）饲养层细胞，吸弃饲养层培养液，换用专用的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）培养液，取ES细胞5x105个，均匀种植到饲养层细胞的表面。结果胚胎干细胞（ES）接种到MEF饲养层两天后细胞聚集生长形成ES克隆。克隆逐渐增大，隆起生长，呈岛屿状。克隆边缘清楚，结构致密，与周围的饲养层细胞界限清楚。实验四MEF饲养层上的ES细胞分化情况的观察目的观察胚胎干细胞在饲养层上分化情况。方法1.碱性磷酸酶(AKP)染色将两种饲养层上的胚胎干细胞用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛溶液室温下固定10min，再用PBS洗三次，加入NBT/BCIP作用20-30min，倒置显微镜下观察显色情况，适时流水中止反应。2. OCT-4检测采用免疫荧光法染色技术。室温下用正常驴血清（用PBS按1：10稀释）封闭ES上的非特异特异性抗体。加入OCT-4抗体（用PBS按1：500稀释）于4°°°C CC孵育过夜。PBS多次洗涤以后，加入荧光标记的驴抗兔二抗于室温下孵育1h,PBS多次洗涤后，50%甘油封片。结果免疫荧光法检测ES细胞上OCT4的表达，MEF饲养层上的ES细胞克隆发出绿色荧光。MEF饲养层上的ES细胞克隆碱性磷酸酶(AKP)染色呈紫蓝色。实验结果表明MEF饲养层上的ES细胞仍处于未分化状态，MEF饲养层可以维持胚胎干细胞的多分化潜能，保持其未分化状态。第二部分人胎肺成纤维细胞（hLEF）饲养层对小鼠胚胎干细胞（ES）的支持效果实验一hLEF的丝裂霉素最佳浓度的选择目的选择合适的丝裂霉素浓度，为人胎肺成纤维细胞（hLEF）饲养层做准备。方法消化培养细胞，调整细胞浓度，接种于96孔板中，37 oC、5%CO2培养培养24h。每孔加入MTT溶液（5mg/ml）100μL，继续孵育4h，吸弃培养液，加入DMSO150μL，震荡10min。利用酶标仪492nm波长下比色测定OD值。结果不同浓度的丝裂霉素C，作用不同的时间，对人胎肺成纤维细胞（hLEF）产生的抑制细胞增殖的效果不同。随着药物作用时间的延长和药物浓度的增加，药物对hLEF的增殖抑制作用增强。用浓度为5μg /ml的丝裂霉素C作用1.5h就可以对hLEF产生一定的抑制作用但细胞仍然有明显的增殖现象。用10μg/ml的丝裂霉素C处理细胞1.5~3.5h或者20μg /ml的丝裂霉素C处理细胞1.5h均可以保持hLEF细胞不再增殖也不会死亡。这是丝裂霉素C对人胎肺成纤维细胞（hLEF）的最佳处理浓度和作用时间范围。当丝裂霉素C的浓度过低（<10μg /ml）不能有效的抑制hLEF的增殖。而丝裂霉素C浓度过高（>20μg/ml），同时作用的时间又过长（>1.5h）则会引起hLEF细胞死亡。实验二hLEF饲养层的制备目的制备hLEF饲养层,为小鼠ES的培养做准备。方法取对数生长期hLEF，用终浓度10μg/ml丝裂霉素C处理2.5h。PBS充分洗涤五次。消化细胞调整浓度为0.5x106/ml,均匀种植到经过0.1%明胶包被的6孔板里。结果经丝裂霉素C处理过的hLEF细胞迅速融合成片，连接紧密单层生长。倒置显微镜下观察细胞大多呈梭形，胞体透明、大小一致，排列规则、边界清楚。选择适当的丝裂霉素C的浓度和作用时间对饲养层的制备很关键。本实验中选择了浓度为10μg/ml的丝裂霉素C对hLEF的处理2.5h, hLEF饲养层细胞不再增殖同时保持良好的生存状态。丝裂霉素C处理过的hLEF细胞大约可以存活2~3w。实验三小鼠ES细胞在hLEF饲养层上的生长特征目的观察小鼠胚胎干细胞（ES）在hLEF饲养层上的生长情况。方法选取状态良好的的胚胎干细胞种植到hLEF饲养层细胞，吸弃饲养层培养液，换用专用的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）培养液，取ES细胞5x105个，均匀种植到饲养层细胞的表面。结果胚胎干细胞（ES）接种到hLEF饲养层后第二天观察细胞，ES克隆散在分布在饲养层细胞表面，ES克隆很小呈现一个个小圆点，凸起尚不明显。2~3d后克隆逐渐增大，ES细胞克隆呈现集落状（岛屿状）隆起生长，边缘清楚，结构致密，形成的克隆细胞之间的界限不明。同样的培养条件下，培养同样的天数，与MEF饲养层上的ES细胞克隆相比，hLEF饲养层上的ES细胞克隆生长较慢，克隆较小，不饱满。实验四hLEF饲养层上的ES细胞分化情况的观察目的检测hLEF饲养层是否可以维持ES细胞的未分化状态。方法1.碱性磷酸酶(AKP)染色将两种饲养层上的胚胎干细胞用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛溶液室温下固定10min，再用PBS洗三次，加入NBT/BCIP作用20-30min，倒置显微镜下观察显色情况，适时流水中止反应。2. OCT4检测采用免疫荧光法染色技术。室温下用正常驴血清（用PBS按1：10稀释）封闭ES上的非特异特异性抗体。加入OCT4抗体（用PBS按1：500稀释）于4°°°C CC孵育过夜。PBS多次洗涤以后，加入荧光标记的驴抗兔二抗于室温下孵育1h, PBS多次洗涤后，50%甘油封片。结果hLEF饲养层上的胚胎干细胞OCT4检测为阳性。荧光显微镜下观察，ES细胞克隆发出绿色荧光。胚胎干细胞的AKP染色后，ES克隆被染成紫蓝色。说明hLEF饲养层可以代替MEF饲养层维持ES细胞的生长状态，保持胚胎干细胞处于未分化状态。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-12
英文摘要  12-16
引言  16-19
  参考文献  17-19
第一部分 MEF饲养层对小鼠胚胎干细胞(ES)的支持效果  19-28
  实验一原代小鼠纤维细胞(M〔F)的制备  19-22
    材料和方法  19-21
    结果  21
    讨论  21-22
  实验二 MEF饲养层的制备  22-24
    材料与方法  22-23
    结果  23
    讨论  23-24
  实验三小鼠ES细胞在MEF饲养层上的生长特征  24-26
    材料和方法  24-25
    结果  25
    讨论  25-26
  实验四 MEF饲养层上的小鼠ES细胞分化情况的观察  26-28
    材料和方法  26-27
    结果  27
    讨论  27-28
第二部分人胎肺成纤维细胞(hELF)饲养层对小鼠胚胎干细胞(MES)的支持效果  28-38
  实验一丝裂霉素最佳浓度的选择  28-32
    材料和方法  28-30
    结果  30-31
    讨论  31-32
  实验二 hLEF饲养层的制备  32-34
    材料与方法  32-33
    结果  33
    讨论  33-34
  实验三小鼠ES细胞hLEF在饲养层上的生长特征  34-36
    材料和方法  34-35
    结果  35
    讨论  35-36
  实验四 hLEF饲养层上的小鼠ES细胞分化情况的观察  36-38
    材料和方法  36-37
    结果  37
    讨论  37-38
小结  38-39
参考文献  39-41
附图  41-45
综述  45-57
  参考文献  54-57
致谢  57

MEF和hLEF对小鼠ES细胞支持作用的比较性研究

内容摘要

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