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HBV核心区基因真核表达的实验研究

作　者: 罗昊翔
导　师: 申元英
学　校: 大理学院
专　业: 病原生物学
关键词: 乙型肝炎病毒 感染 基因重组 基因表达 基因整合
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的1、研究HBV对HepG2细胞的自然感染及在HepG2细胞中的复制与核心抗原表达2、构建带有HBV调控序列的核心区基因真核表达载体3、研究HBV核心区基因在HepG2细胞中的表达及其上游调控序列对核心区基因的调控4、研究HBV DR区整合方法1、用HBV DNA荧光定量1.5×1010copies/ml的大三阳血清自然感染HepG2细胞,ELISA检测HBeAg,免疫组化检测HBcAg, PCR检测HBV cccDNA, RT-PCR检测HBc mRNA。2、重组PCR扩增带有上游调控序列的HBV核心区基因,双酶切,T4连接酶连接重组体,将该区基因克隆入破坏了CMV启动子的pcDNA3.1(+)载体,构建pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体。3、用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体转染HepG2细胞,G418筛选阳性细胞株,免疫组化检测HBcAg, HBxAg, ELISA检测HBeAg, RT-PCR检测HBx mRNA及HBc mRNA。4、从整合有HBV X-C基因的HepG2细胞中提取总DNA, PCR扩增X-C片段、X基因片段及C基因片段。结果1、感染12h后,ELISA检测到细胞培养上清中HBeAg,以后迅速下降,免疫组化未检测到HepG2细胞中存在HBcAg, RT-PCR未检测到HBc mRNA,跨双缺口引物也一直未检测到HBV cccDNA.2、建立了重组PCR扩增跨双缺口HBV X-C基因序列的方法,成功构建了pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体。3、重组pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体可在HepG2细胞中表达出HBcAg,但ELISA未检测出HBeAg。4、经筛选后的阳性细胞株中,PCR只能检测出X基因片段及C基因片段,但一直未扩增出X-C整段DNA。结论1、使用HBV大三阳血清中的病毒是否可以感染HepG2细胞还需进一步研究。2、建立了重组PCR扩增跨双缺口HBV X-C DNA序列的方法,成功构建了pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体,为以后对HBV核心区基因表达调控的研究奠定基础。3、HBV核心区基因在其自身上游调控序列的调控下,在HepG2细胞内可成功启动其表达,但HBeAg的分泌除了受到基因调控因素的影响外,可能还受到其他一些因素的影响。4、X基因和C基因分别整合入HepG2细胞基因组,但是X-C DNA片段未能完整整合入HepG2细胞基因组,可能HBV DR还保留有复制及整合功能。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
第一章 前言  9-19
第二章 材料  19-24
第三章 实验方法结果  24-41
  第一部分 HBV自然感染HepG2细胞、HBV在HepG2中的复制及核心区基因在HepG2中的表达  24-29
    一、实验方法  24-26
    二、结果  26-29
  第二部分 重组HBV核心区基因在HepG2中的表达、DR区复制及整合  29-41
    一、实验方法  29-37
      1、重组PCR扩增HBV X-C基因方法的建立  29-31
      2、重组pcDNA3.1(+)HBV X-C基因在HepG2细胞中的表达及DR区整合  31-37
    二、结果  37-41
第四章 讨论  41-46
第五章 结论  46-47
参考文献  47-51
文献综述  51-54
攻读硕士期间发表的论文、专著和获奖情况  54-55
致谢  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性肝炎 > 乙型肝炎
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