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乙肝病毒X蛋白对肝癌HepG2细胞DNA双链断裂修复的影响

作　者: 刘庆
导　师: 林菊生
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: DNA双链断裂乙型肝炎病毒X蛋白修复
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究表明乙型肝炎病毒(HBV)是引起原发性肝细胞肝癌的最主要病因之一,乙型肝炎病毒X蛋白(HBVx)是乙肝病毒基因翻译的重要蛋白之一。在乙肝病毒相关性肝癌的发生过程中,HBVx作为促肿瘤的辅助因子扮演着多种角色。肿瘤发生的起始大多来自于各种原因引起的DNA损伤,其中HBVx能刺激细胞线粒体产生氧应激反应(ROS),导致氧自由基等有害物质增多,引起不同程度的DNA损伤包括DNA双链断裂(DSBs)。宿主对DSBs正确修复过程如果受到某些干扰或采用不恰当的修复方式,则可能会导致基因组的不稳定或将导致乙肝病毒DNA片段的整合,普遍认为这是乙型肝炎相关性肝癌发生的重要步骤之一。然而目前,HBVx对DNA双链断裂修复机制的影响还有待深入的研究。目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBVx)对药物博莱霉素诱导HepG2细胞DNA双链断裂(DSBs)损伤修复的影响,包括细胞周期的变化及对DSB损伤同源重组修复关键调节蛋白CtIP的影响。为研究HBVx对肝细胞DSB损伤修复干扰的分子机制及乙肝相关性肝癌的发病机制探索新的研究思路。方法建立稳定表达HBVx蛋白的HepG2肝癌细胞株,同时稳定转染空质粒作为对照;分别检测药物博莱霉素诱导两种稳定转染基因细胞株DSB损伤后的生物学改变,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,分别使用Real-time PCR及Western blot方法检测DSB损伤后HR修复调控蛋白CtIP的mRNA与蛋白表达水平,并用免疫共聚焦显微镜观察CtIP蛋白在细胞内定位表达情况,研究乙肝病毒X蛋白对DSB损伤修复的影响。结果我们发现稳定转染乙型肝炎病毒X基因的HepG2细胞株能稳定表达HBVx蛋白,对DSB损伤敏感性增强。细胞凋亡检测显示,药物处理后,HBVx蛋白稳定表达HepG2细胞株相比较于对照细胞株细胞凋亡数无显著性差异(P>0.05),但死亡细胞数更多且有显著性差异(P<0.05),未用药物处理的两组细胞株细胞凋亡和细胞死亡均无显著性差异(P>0.05)。细胞周期检测发现,HBVx蛋白的表达使细胞周期S期缩短,G2期细胞增多;药物处理后两种细胞株都出现了细胞周期G2/M期阻滞,HBVx蛋白稳定表达HepG2细胞株相比较于对照细胞株出现更多细胞周期G2/M期阻滞且有显著性差异(P<0.05)。另外,通过蛋白Western Blot检测分析,发现乙肝病毒X蛋白干扰了抑癌基因CtIP的蛋白表达,使CtIP蛋白表达水平下调(P<0.05),用Real-time PCR方法检测CtIP蛋白mRNA水平下调(P<0.05),同时免疫共聚焦显微镜观察到CtIP蛋白在细胞核内定位聚集情况。结论我们的研究表明,HBVx蛋白能通过干扰肿瘤抑制蛋白CtIP的表达影响细胞DSB损伤的修复,这可能损伤细胞同源重组修复能力,促使肝细胞过多采取易发生碱基丢失和错配的非同源末端连接(NHEJ)修复的方式进行DSB损伤修复,甚至导致HBV基因片段整合到肝细胞基因组中,从而引起肝细胞的死亡或基因的不稳定。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
前言  12-14
实验材料  14-16
第一部分乙肝病毒X 蛋白稳定表达细胞系及DNA 双链断裂损伤细胞模型的建立  16-25
  方法及步骤  16-21
  结果  21-22
  讨论  22-24
  附图  24-25
第二部分乙型肝炎病毒X 蛋白对DSB 损伤修复影响效应的检测  25-38
  方法及步骤  25-29
  结果  29-30
  讨论  30-34
  附图  34-38
参考文献  38-40
综述  40-52
  参考文献  48-52
致谢  52

乙肝病毒X蛋白对肝癌HepG2细胞DNA双链断裂修复的影响

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