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急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+T淋巴细胞受体α和β链取用的研究

作　者: 叶海燕
导　师: 刘永明
学　校: 桂林医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 乙型肝炎病毒细胞毒T淋巴细胞 T细胞受体 CDR3 免疫反应
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

全球有超过3.5亿HBV慢性感染患者,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可引起急慢性肝炎,肝硬化及肝细胞癌等,严重危害着人类的健康。虽然乙型肝炎的发病机制仍不完全清楚,病毒的清除涉及到很多因素,如机体本身,病毒,以及机体免疫反应应答能力等,但目前研究比较一致认为,HBV是非直接致细胞病变病毒,它自身并不引起肝细胞损害,肝脏的损伤是由免疫应答反应所致,其中特异性CD8~+ T淋巴细胞即特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)免疫应答反应在清除病毒和决定疾病转归中发挥重要作用。急性乙型肝炎患者体内存在较强的多特异性CTL反应,对清除感染病毒发挥关键作用,同时也与免疫病理损伤的程度和类型密切相关;而慢性乙型肝炎患者的外周血中往往CTL反应很弱或针对的病毒抗原表位单一,是HBV不能被及时清除的重要因素。引起这种HBV特异性CTL反应差异的分子机制目前尚不完全清楚。由于CTL的特异性取决于细胞表面的T细胞受体(T cell receptor,TCR),而TCR的特性主要决定于α和β链可变区(V区)的分子组成,因此,揭示特异性CD8~+ T细胞的TCR分子的组成特性十分重要。本研究的目标是分析急性乙肝患者HBV抗原表位特异性CD8~+ T细胞TCRα和β链的取用特点,帮助阐明急性乙型肝炎患者特异性细胞免疫应答的特点及其分子机制,同时获取特异性CD8~+ T细胞TCRα和β链可变区的序列信息,帮助阐明HBV的免疫致病和免疫清除机理,并为乙型肝炎的免疫治疗提供支持。目的1.建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)α和β链可变区基因的方法。2.分析急性乙型肝炎患者外周血中HBV特异性CD8~+ T细胞的频率。3.分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+ T细胞受体Vα和Vβ亚家族特点。方法1.根据32个TCR Vα和25个TCR Vβ亚家族基因序列特点,分别设计Vα基因的上游内、外引物各42条以及Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条。在α链以及β链的恒定区(C区)设计下游内、外引物和测序引物各1条以及扩增Cα和Cβ基因的上游引物各1条。提取正常人CD8T细胞的RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人CD8 T细胞32个Vα和25个Vβ亚家族基因,并用Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆PCR产物,对克隆基因进行测序。2.运用MHC肽五聚体法结合流式细胞技术检测急性和慢性乙型肝炎患者外周血HBsAg335-343和HBsAg183-191抗原表位特异性CD8~+ T细胞频率;同时分析急性乙型肝炎患者特异性CD8~+ T细胞的频率分别与血清ALT水平及病毒载量之间的关系;动态分析急性乙型肝炎患者外周血的HBsAg335-343特异性CD8~+ T细胞的频率变化。3.从3例HLA*0201急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),用HBsAg S335-343抗原表位多肽和细胞因子刺激PBMC以诱导抗原表位特异性CD8~+ T细胞的增殖,用流式细胞仪分选特异性CD8~+ T细胞到96孔培养板,培养10~14 d后,提取细胞的RNA,PolyA介导反转录,巢式PCR扩增TCR Vα和Vβ,并用3例患者的非特异性CD8~+ T细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序分析。结果1.从正常人的CD8 T细胞中扩增到所有TCR Vα和Vβ亚家族基因,克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCR Vα1和Vβ8基因,经测序验证与文献报道一致,且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。2.急性乙型肝炎患者的HBsAg335-343特异性CD8~+ T细胞的阳性率为0.45%±0.52%,HBsAg183-191特异性CD8~+ T细胞阳性率为0.19%±0.22%。慢性乙型肝炎患者的HBsAg335-343特异性CD8~+ T细胞阳性率为0.05%±0.04%,HBsAg183-191特异性CD8~+ T细胞阳性率为0.08%±0.10%。比较急性期患者,HBsAg335-343特异性CD8~+ T细胞阳性率与血清ALT水平及病毒载量的相关性分析得出P值均大于0.05,无显著相关性;HBsAg183-191特异性CD8~+ T细胞阳性率与血清ALT水平及病毒载量的相关性分析得出P值均大于0.05,无显著相关性。然而在恢复期,HBsAg335-343特异性CD8~+ T细胞的阳性率明显下降。3. 3例急性乙型肝炎患者的HBsAg 335-343表位特异性CD8~+ T细胞表达的TCR Vα和Vβ亚家族基因的种类和数目都各不同,但是均优势表达了Vα2、Vα3、Vα15、Vα20亚家族基因以及Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ7、Vβ13、Vβ14、Vβ16亚家族基因。序列比对结果得知3例患者的HBsAg 335-343表位特异性CD8~+ T细胞的TCR的CDR3具有不同的长度和序列。结论1.建立了一种高效灵敏的TCRα和β链可变区基因的扩增方法,为抗原特异性CD8~+ T细胞TCR克隆和谱系利用研究提供了技术支持。2.发现了急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+ T细胞TCR存在优势利用的特点,并提示TCR优势利用是由于针对同一抗原的特异性CD8~+ T细胞克隆性增殖所致,这一发现为抗病毒CTL应答中TCR优势利用对病毒清除有利的假说提供了新的支持证据。3.首次克隆了中国乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+ T细胞优势TCRα和β链编码基因,为TCR转基因表达进行特异性CTL功能分析和进一步的基因治疗研究提供了实验材料。

急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+T淋巴细胞受体α和β链取用的研究

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