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骨髓间充质干细胞与聚乳酸—羟基乙酸支架材料相容性以及修复周围神经损伤的实验研究

作　者: 符厚圣
导　师: 周兴
学　校: 广州医学院
专　业: 泌尿外科
关键词: 骨髓间充质干细胞神经样细胞聚乳酸-羟基乙酸支架材料相容性
分类号: R651.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

实验目的:研究骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)及其分化的神经样细胞与聚乳酸-羟基乙酸(polylactic glycolic acid,PLGA)支架材料在体外和体内的相容性,并探讨两者复合修复周围神经损伤(Peripheral Nerve Injury,PNI)的效果,为进一步移植修复脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)和糖尿病及其引起的神经源性膀胱提供坚实的研究基础。实验方法:1.采用贴壁筛选法培养大鼠BMSCs,观察原代及传代BMSCs形态特点、生长特性和特殊染色,通过流式细胞仪检测细胞表面抗原表达,探讨其作为神经组织工程种子细胞的可行性;2.采用神经细胞诱导液诱导BMSCs形成神经样细胞球,并进一步促进其定向分化成特异性的神经细胞,通过免疫细胞化学染色以及荧光显微镜等观察细胞的诱导分化情况;3.体外研究:四甲基偶氮唑盐3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)技术检测BMSCs复合PLGA培养后细胞增殖情况;碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)染色剂检测细胞周期;通过扫描电镜等技术观察BMSCs以及分化生成的神经样细胞在PLGA上粘附及生长情况;4.体内研究:分别将单纯的PLGA、BMSCs-PLGA复合物以及神经样细胞-PLGA复合物分别移植入3组右侧坐骨神经损伤的SD大鼠模型中,术后观察4组动物60d,通过斜板实验观察大鼠右下肢肌力、运动功能恢复情况,通过组织学及肌电图(Electro- myography,EMG)观察右侧坐骨神经恢复情况。实验结果:1.经贴壁筛选法培养所得到的细胞,符合BMSCs的结构特征和生长特点;经流式细胞仪检测,细胞仅表达间质类细胞的表面标记物,而不表达淋巴细胞、巨噬细胞等表面标记产物;与相应的抗体染色后荧光显微镜下可见到带有绿色荧光的BMSCs形态;2.BMSCs经诱导后呈球状悬浮生长,免疫细胞化学染色呈Nestin阳性;经添加血清诱导后有大量细胞从神经球中迁出,分别进行免疫细胞化学染色,可得到MAP-2阳性的神经元细胞、GFAP阳性的星形胶质细胞,3.在体外,MTT检测显示BMSCs在PLGA中有很好的生长活力,其OD值与在培养板中同期培养的细胞OD值无统计学意义(P>0.05),提示BMSCs在PLGA与在培养板中生长无显著差异性。细胞周期检测结果还显示大部分细胞处于静止期,只有少数的细胞处于增殖期,且多为二倍体,说明所培养的细胞符合干细胞特征;扫描电镜发现,BMSCs以及诱导分化生成的神经细胞与支架材料结合较紧密,生物相容性好;4.在体内,肉眼观察示细胞-PLGA复合物与神经组织未见明显界限,绝大部分PLGA已降解;病理切片显示原缺损处的神经组织见有大量的神经纤维细胞,没有明显胶质瘢痕的形成,证明PLGA与宿主神经组织有良好的生物相容性;术后斜板试验显示神经样细胞-PLGA复合组角度高于其他组(P<0.01);肌电图显示神经样细胞-PLGA复合组神经传导和肌肉恢复快于其他组。结论:1.采用贴壁筛选法分离和培养BMSCs是可行的;2.BMSCs具有多向分化的潜能,在体外可诱导为神经样细胞球,并能进一步定向分化为特异性的神经细胞;3.BMSCs以及诱导分化生成的神经样细胞在体外、体内培养显示,以BMSCs作为组织工程的种子细胞是可行的;4.PLGA是一种生物相容性良好的神经组织工程材料,有利于种子细胞的粘附、生长、分化,与细胞复合后能修复大鼠损伤的坐骨神经,促进下肢运动功能的恢复。5.组织工程材料联合细胞修复SCI后膀胱功能是可行的。

骨髓间充质干细胞与聚乳酸—羟基乙酸支架材料相容性以及修复周围神经损伤的实验研究

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