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RGD-蛛丝蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维小直径血管支架的研究

作　者: 向萍
导　师: 李敏；陈登龙
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小直径血管支架 RGD-蛛丝蛋白 聚己内酯 明胶 静电纺丝 生物相容性
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


自体血管和人工合成血管是临床上主要的血管移植物,但白体血管因受来源限制,很难满足临床需求。人工合成血管材料如涤纶(Dacron)和膨胀聚四氟乙烯(ePTFE),在大直径血管(内径>6mm)移植中取得了较好的效果,但应用在小直径血管(内径<6mm)的移植中易导致内膜增生、血栓形成和阻塞等现象。血管组织工程技术为小直径血管移植物提供了新思路,制备理想的血管支架是血管组织工程重要的研究内容。本研究在课题组前期将RGD-蛛丝蛋白(含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列,命名为pNSR32,分子量约为102KD)与聚己内酯(Polycaprolacton, PCL)共混,应用静电纺丝技术制备纳米纤维膜的基础上,添加亲水性良好的明胶(Gelatin, Gt),设计五组pNSR32/PCL/Gt三元共混材料体系,电纺结合旋转接收装置,制备pNSR32/PCL/Gt复合纳米纤维小直径血管支架,对所制备支架的理化性能进行表征并研究支架的生物相容性。研究结果如下：一、以Ⅰ型胶原酶消化与组织贴壁法相结合,建立了简单高效的Sprague-Dawley(SD)大鼠主动脉内皮细胞(SDRAECs)分离方法,倒置显微镜及伊红染色观察,分离的细胞呈多角形,铺路石状排列,为典型的内皮细胞形态。对内皮细胞特异性因子-Ⅷ因子免疫组织化学及免疫荧光染色,证实获得的细胞均为内皮细胞。二、在前期pNSR32与PCL共混电纺的基础上加入Gt,改善支架的亲水性。以98%的甲酸为共同溶剂,设计五组配比(质量比)的共混体系：A组.pNSR32/PCL/Gt(0:100:0)、B组.pNSR32/PCL/Gt(5:95:0)、C组pNSR32/PCL/Gt(5：85：10)、D组,pNSR32/PCL/Gt(5:75:20)、E组pNSR32/PCL/Gt (5:65:30)。电纺参数：纺丝液浓度30%,电压80kV,固化距离20cm,挤出速度80(μL/min,转轴外径3mm,转轴转速2rpm,制备了长3cm、厚0.3mm、内径3mm的复合纳米纤维小直径血管支架。三、对A-E五组配比制备的小直径血管支架的理化性能进行表征。测试了支架的纤维直径、孔径、孔隙率、吸水率以及接触角,发现随着Gt量的增加,支架纤维直径、孔径、孔隙率、吸水率均逐渐增大,接触角显著减小。傅立叶红外光谱(Fouriertransform infrared spectroscopy, FTIR)观察到pNSR32、PCL、Gt三者间无新化学键形成,乙醇处理未改变支架的构象；X-射线衍射(X-ray diffraction, XRD)结果证实pNSR32与Gt的加入可增加支架结晶度。pNSR32/PCL/Gt复合支架在PBS中的降解速率慢于多酶降解液,pNSR32与Gt的加入促进支架的降解速率,并与Gt的加入量成正相关。对C组配比支架的力学性能进行检测,结果为pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架在干燥状态下极限抗张强度2.67±0.22MPa,生理盐水浸泡24h后,极限抗张强度降为1.59±0.16Mpa,断裂伸长率从117%±15%上升至177%±13%,其缝合强度为3.6±1.2N,符合手术要求。四、探讨A-E五组配比制备的小直径血管支架的细胞相容性。MTT比色法比较各组支架的细胞毒性,五组配比支架浸提液对SDRAECs均无毒性,毒级在1级以内,符合生物材料要求。SDRAECs与支架复合培养分析支架对细胞生长、增殖、周期及表型的影响,观察到Gt的加入改善了支架材料的细胞相容性,适宜的Gt含量(10%,C组)能提高支架的细胞相容性。具体结果：SDRAECs在C组配比支架细胞的增殖速率最快；SEM观察,DAPI染色及冰冻切片HE染色证实C组配比支架与A组,B组支架相比,能更好地支持SDRAECs粘附、生长、增殖；流式细胞技术检测C组配比支架可促进DNA复制,加速细胞增殖；免疫组化结果说明SDRAECs在C组配比支架上能正常表达Ⅷ因子；免疫荧光检测表明C组配比支架支架较组织培养板(Tissue culture plate, TCP)更有利于SDRAECs增殖及功能的维持。五、探讨A-E五组配比制备的小直径血管支架的血液相容性。溶血试验结果表明A-E五组配比支架的溶血率分别为0.26%、0.13%、0.26%、0.55%、0.91%,均符合生物材料的溶血要求(<5%)。复钙化凝血时间实验观察到C组配比支架的复钙化时间与B组相似,但均比A组支架的时间长,说明C组、B组支架抗凝性能优于A组支架。动态凝血时间测定结果提示C组配比支架抗凝血能力较强。血小板黏附试验发现在C组配比支架上的血小板粘附数均较B组与A组支架少。综上结果,C组配比即pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架具有优良的血液相容性。六、评价pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)复合纳米纤维小直径血管支架的遗传毒性。小鼠骨髓微核试验结果发现pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液的微核发生率为2.3‰±0.9‰,与生理盐水组(2.8‰±1.3‰)类似,显著低于环磷酰胺组(23.3‰±4.2‰)。单细胞凝胶电泳试验结果表明pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液没有造成SDRAECs的DNA损伤。七、探讨pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)复合纳米纤维小直径血管支架的体内生物相容性。全身急性毒性试验结果表明pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液注射昆明小鼠体内后96h,小鼠未表现中毒症状,体重增加量与生理盐水对照组无显著差异(p>0.5)。pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架植入SD大鼠肌肉,30d后炎症反应与医用胶原对照组及空白对照组类似,炎症细胞基本消失,纤维囊壁趋向变薄,肌纤维结构排列有序,出现大量新生血管。对炎症程度评定均为1级,符合标准要求。结论：Gt的加入改善了支架材料的性能,适宜的Gt含量(10%)能提高支架的生物相容性。pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)复合纳米纤维小直径血管支架,理化性能良好,生物相容性优异,作为小直径血管组织工程支架材料应用于临床具有一定的可行性。

全文目录


中文摘要  2-5
Abstract  5-9
中文文摘  9-14
目录  14-16
绪论  16-26
  一、心血管疾病现状概述  16
  二、血管组织工程支架材料  16-21
  三、组织工程小直径血管支架制备技术  21-23
  四、血管组织工程支架生物相容性评价  23-24
  五、本研究的背景、内容及意义  24-26
第一章 大鼠主动脉内皮细胞分离培养新方法  26-36
  第一节 材料与仪器  26-27
  第二节 方法  27-30
  第三节 结果  30-31
  第四节 讨论  31-32
  第五节 结论  32-33
  附图  33-36
第二章 pNSR32/PCL/Gt复合纳米纤维小直径血管支架制备及其理化性能表征  36-52
  第一节 材料与仪器  36-37
  第二节 方法  37-40
  第三节 结果  40-44
  第四节 讨论  44-46
  第五节 结论  46-47
  附图  47-52
第三章 pNSR32/PCL/Gt复合纳米纤维小直径血管支架细胞相容性研究  52-64
  第一节 材料与仪器  52-53
  第二节 方法  53-56
  第三节 结果  56-58
  第四节 讨论  58-59
  第五节 结论  59-60
  附图  60-64
第四章 pNSR32/PCL/Gt复合纳米纤维小直径血管支架血液相容性研究  64-70
  第一节 材料与仪器  64-65
  第二节 方法  65-66
  第三节 结果  66-67
  第四节 讨论  67-68
  第五节 结论  68-69
  附图  69-70
第五章 pNSR32/PCL/Gt复合纳米纤维小直径血管支架遗传毒性研究  70-78
  第一节 材料与仪器  70-71
  第二节 方法  71-73
  第三节 结果  73-74
  第四节 讨论  74-75
  第五节 结论  75-76
  附图  76-78
第六章 pNSR32/PCL/Gt复合纳米纤维小直径血管支架体内生物相容性研究  78-86
  第一节 材料与方法  78-79
  第二节 方法  79-80
  第三节 结果  80-83
  第四节 讨论  83
  第五节 结论  83-85
  附图  85-86
第七章 结论  86-90
附录  90-92
参考文献  92-102
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  102-104
致谢  104-106
个人简历  106-108

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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