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甘肃省冬虫夏草遗传多样性分析和人工培养条件的研究

作　者: 朱子雄
导　师: 谢放
学　校: 兰州交通大学
专　业: 微生物学
关键词: 冬虫夏草遗传分化活性成分
分类号: S567.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

冬虫夏草是我国一种药食兼用的传统名贵中药材,现代研究证实具有重要的药用价值。甘肃省是我国冬虫夏草的主要产地之一。为调查甘肃省三个主要产区所产冬虫夏草种类的系统发育及遗传分化,本研究开展了以甘肃省几个冬虫夏草主产区的虫草资源进行分子系统学分析和相关研究。主要研究结果如下：1.本研究从来自甘肃三个主要产区采集的冬虫夏草上分离到18个菌株,筛选出最佳培养基,研究其对温度的适应性,低温下生长较慢,18℃为最适生长温度,25℃及其以上不能生长,并首次通过在培养基中斜插盖玻片的方法在光学显微镜下清晰观察菌丝和分生孢子形态；通过特殊培养在三角瓶中长出与野生冬虫夏草“草头”相同的子实体。从形态学上判定分离的菌株为中国被毛孢。2.采用改进的CTAB法对菌株基因组DNA进行提取。经紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测分析。方法是,在提取缓冲液中加入PVP和β-巯基乙醇,同时采用tris-平衡饱和酚/氯仿/异戊醇,氯仿/异戊醇相结合的抽提法,通过加入3mol/LNaAc,经冰冻无水乙醇沉降和70%乙醇多次洗涤。结果显示,经改良后的CTAB法提取的基因组DNA片段完整、纯度高、质量好满足后续实验要求。3.通过优化ISSR反应体系首次确定了冬虫夏草25μL ISSR-PCR反应体系为10×PCRBuffer 2;模板20ng;dNTP 0.12 mmol/L; Mg2+1.5 mmol/L; ISSR引物0.9μmol/L Taq DNA聚合酶0.5U。4.采用简单序列例重复(ISSR)区间扩增多态性分析和I8S rDNA序列分析法,对18个菌株进行标记和系统发育分析。在ISSR分析中显示出不同地域的样本间遗传分化较大,遗传多样性较丰富；同一地域不同地点间样本存在遗传分化；同一地点样本间存在较小遗传分化；分离自同一株虫草上的菌株之间不存在遗传分化。在18S rDNA系统发育分析中显示出在同一地域不同地点样本间和同一地点不同样本间具有较小的遗传分化：分离至同一株虫草上不同部位的菌株不存在遗传分化。5.通过PCR技术扩增出18个菌株间18S部分序列,通过测序分析。结果显示18SrDNA序列长372bp。序列比对发现,各分离物与中国被毛孢(Hirsutella sinensis)之间仅有1-2个碱基的差异,相似性高达99%,遗传距离在0.01以下。说明18个菌株与H. sinensis彼此间在基因水平上是高度一致的。为了进一步比较分离菌株无性型与中国被毛孢之间的关系,以蛹虫草(Cordyceps militaris)和球孢菌(Cordyceps bassiana)作外群,并与同源性相关的菌物构建分子系统树,结果显示18个分离菌株的无性型为中国被毛孢。6.首次采用苯酚-硫酸法测定中国被毛孢菌丝体多糖含量,高碘酸钠比色法测定甘露醇含量,反相高效液相色谱法测定腺苷和虫草素含量。结果表明,天然冬虫夏草中存在虫草素且在甘肃不同产区分离得到的虫草菌多糖含量在1.66%～2.36%之间,甘露醇含量在2.04%～5.72%之间,虫草素和腺苷的含量分别在47.213～76.927μg/g、249.778～439.797μg/g；同一产区不同地方分离到的虫草菌多糖含量在1.79%-2.00%之间,甘露醇含量在1.62%～1.79%之间,虫草素和腺苷的含量分别在45.331～49.96μg/g、92.404～376.375μg/g。通过显著性分析说明不同产地菌株间的活性成分含量差异显著;同一产区菌株间除腺苷外活性成分含量差异不显著。从多糖含量和腺苷含量上可以看出从甘南冬虫夏草上分离得到的菌株较优亦说明甘南虫草质量最好。同时说明在甘南产区中以加仓虫草质量最优。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 绪论  11-23
  1.1 冬虫夏草的生物学特性  11-18
    1.1.1 冬虫夏草的形态特征与分布  11-12
    1.1.2 冬虫夏草寄主特征与研究  12-13
    1.1.3 冬虫夏草菌的研究概况  13-16
    1.1.4 分子生物学技术在系统分类及冬虫夏草研究中的应用  16-18
  1.2 冬虫夏草的主要活性成份及药理作用  18-21
    1.2.1 虫草多糖  19
    1.2.2 甘露醇  19
    1.2.3 虫草素  19-20
    1.2.4 腺苷  20-21
  1.3 冬虫夏草主要活性成份的提取和测定方法  21
    1.3.1 虫草多糖和甘露醇的提取和测定方法  21
    1.3.2 核苷类的提取和测定方法  21
  1.4 本研究的目的和意义  21-23
2 材料与方法  23-33
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 实验材料  23
    2.1.2 实验仪器  23
    2.1.3 实验药品  23-24
    2.1.4 培养基和溶液的配制  24-25
  2.2 实验方法  25-27
    2.2.1 冬虫夏草菌的分离与纯化  26
    2.2.2 培养基的筛选及菌落形态观察  26
    2.2.3 最适温度的选择  26
    2.2.4 菌种的培养  26-27
    2.2.5 菌丝的观察  27
  2.3 DNA的提取及测定  27-28
    2.3.1 DNA的提取  27
    2.3.2 DNA纯度及浓度分析  27-28
  2.4 ISSR-PCR技术  28-29
    2.4.1 ISSR反应体系及反应程序的选用  28
    2.4.2 引物设计与合成  28
    2.4.3 ISSR-PCR反应体系的优化  28-29
    2.4.4 ISSR-PCR扩增  29
    2.4.5 ISSR数据统计  29
  2.5 18S rDNA技术  29-30
    2.5.1 引物设计与合成  29
    2.5.2 扩增反应  29-30
    2.5.3 扩增产物的检测与测序  30
    2.5.4 DNA序列分析  30
  2.6 系统进化及多样性分析  30-31
    2.6.1 同源性比较及同源树的构建  30-31
    2.6.2 系统发育分析  31
  2.7 冬虫夏草菌主要活性成分测定  31-33
    2.7.1 虫草多糖和甘露醇的提取及含量测定  31
    2.7.2 虫草素和腺苷的提取及含量测定  31-33
3 结果与分析  33-50
  3.1 菌株的分离、培养与观察  33-37
    3.1.1 冬虫夏草菌的分离  33-34
    3.1.2 冬虫夏草菌固体培养基的筛选  34-35
    3.1.3 冬虫夏草菌落特征  35-36
    3.1.4 冬虫夏草菌最适温度的选择  36-37
    3.1.5 菌丝显微观察  37
  3.2 DNA的检测  37-38
    3.2.1 基因组DNA的电泳检测  37
    3.2.2 DNA浓度及纯度检测  37-38
  3.3 ISSR-PCR分析  38-43
    3.3.1 引物筛选  38
    3.3.2 反应体系的优化  38-40
    3.3.3 ISSR-PCR扩增  40
    3.3.4 ISSR扩增多态性  40-41
    3.3.5 聚类分析  41-43
  3.4 18S rDNA-PCR分析  43-47
    3.4.1 扩增产物电泳图谱  43
    3.4.2 测序分析  43-44
    3.4.3 18个菌株无性型的分子鉴定  44-45
    3.4.4 同源性树比较及同源树的构建  45
    3.4.5 基因系统发育分析  45-47
  3.5 主要活性成份测定  47-50
    3.5.1 虫草多糖和甘露醇测定  47-48
    3.5.2 虫草素和腺苷测定  48-49
    3.5.3 不同产区活性成份含量比较  49
    3.5.4 同一区域活性成份含量比较  49-50
4 讨论  50-53
  4.1 培养基的选择  50
  4.2 基因组DNA提取方法的改进  50
  4.3 ISSR研究分析  50-51
  4.4 无性型的鉴定  51
  4.5 甘肃虫草资源的分子系统学分析  51-52
  4.6 冬虫夏草质量标准  52-53
结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-60
附录A 活性成分多重比对结果表  60-63
附录A 序列比对结果  63-66
附录A ISSR扩增部分电泳图  66-67
攻读学位期间的研究成果  67

甘肃省冬虫夏草遗传多样性分析和人工培养条件的研究

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