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转座子PgPLE1种群插入多态性研究

作　者: 王常春
导　师: 王建军
学　校: 扬州大学
专　业: 农业昆虫与害虫综合防治
关键词: 棉红铃虫 piggyBac类转座子插入位点偏好插入多态性细胞色素氧化酶Ⅰ基因遗传分化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

棉红铃虫是重要的棉花害虫,在全世界许多国家和地区都有危害报道。利用粉纹夜蛾piggyBac作为载体的转基因(EGFP,增强型绿色荧光蛋白)棉红铃虫已获得成功,并且成为目前唯一获准登记用于田间释放试验的转基因农业害虫。piggyBac是一种从粉纹夜蛾中分离到的、具有TTAA插入位点特异性的DNA转座子。piggyBac可在昆虫基因组中准确切离,转化频率较高,并且不受宿主因子的限制,是目前转基因昆虫研究中最有应用前景的转座子载体。本文分析了piggyBac类转座子PgPLE1在棉红铃虫基因组中的插入特性、转录和转座活性及种群插入多态性,并结合线粒体DNA CO I分子标记分析了棉红铃虫种群遗传变异。应用vectorette PCR获得了棉红铃虫piggyBac转座子PgPLE1 8个插入位点的侧翼序列,并在此基础上对PgPLE1基因组插入特性进行分析。结果表明,PgPLE1大多数拷贝在基因组中特异性插入TTAA靶标位点,6个拷贝插入基因非编码区,一个拷贝插入区域与黑腹果蝇反转录转座子Tirant的gag蛋白同源性为30%,另一个拷贝插入区域与家蚕非LTR反转录转座子的反转录酶同源性为53%。通过RT-PCR和vectorette PCR分析了转座子PgPLE1的转录和转座活性。以棉红铃虫cDNA为模板的RT-PCR检测到PgPLE1 3种不同大小的转录产物,克隆和测序发现,其中一个转录产物编码完整的转座酶。通过琼脂糖凝胶电泳对以棉红铃虫父代与F1子代个体基因组DNA为模板的3′vectorette PCR扩增产物的对比分析发现,PgPLE1在F1子代两个个体的基因组插入位点发生变化,表明PgPLE1具有转座活性。通过PCR检测了PgPLE1在江苏句容、湖北仙桃、湖南安乡和岳阳以及美国亚利桑那等5个棉红铃虫地理种群中的插入多态性,并在此基础上分析了宿主种群遗传关系。PgPLE1的5个插入位点在各种群中的基因型分布大都符合Hardy-Weinberg平衡,各插入位点的平均基因频率介于0.0050～0.2400之间。以各种群基因频率为基础,对棉红铃虫5个地理种群间的遗传距离和系统发生分析表明,棉红铃虫种群间遗传关系与地理分布基本一致,表明转座子插入多态性可用于昆虫种群遗传分化研究。对江苏句容、湖北洪湖和仙桃、湖南安乡和岳阳以及美国亚利桑那等6个棉红铃虫地理种群40个个体的线粒体DNA COⅠ基因部分序列进行了测定和分析。在获得的760bp序列中,共鉴定了5个多态性位点和6种单倍型,其中独享单倍型有4个,表明这些地理种群之间已出现一定程度的遗传分化。AMOVA和遗传距离分析进一步表明,美国亚利桑那和江苏句容种群与其它地理种群间遗传分化水平相对较高,湖南两个种群和湖北两个种群间的遗传距离相对较近。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-27
  1.1 转座子概述  10-17
    1.1.1 转座子分类  10-11
    1.1.2 转座子在宿主基因组中的分布  11
    1.1.3 转座子与宿主基因组进化  11-14
    1.1.4 转座子插入多态性（transposon insertion polymorphisms TIPs）与分子标记  14-17
  1.2 PIGGYBAC 转座子研究进展  17-23
    1.2.1 piggyBac 的结构  17-19
      1.2.1.1 基本结构  17-18
      1.2.1.2 核定位信号（nuclear localization signal NLS)  18
      1.2.1.3 DDE/DDD 基序  18-19
    1.2.2 piggyBac 的转座  19-20
      1.2.2.1 靶位点和基因组插入区域偏好  19-20
      1.2.2.2 转座酶和顺式作用元件对转座的影响  20
    1.2.3 piggyBac 类转座子的分布  20-23
      1.2.3.1 种间分布广泛性  20-21
      1.2.3.2 种内分布多样性  21-23
  1.3 PIGGYBAC 转座子在转基因昆虫中的应用  23-25
    1.3.1 昆虫种系转化载体  23
    1.3.2 影响应用因素  23-25
  1.4 本研究意义  25-27
第二章转座子PGPLE1 基因组插入特性分析  27-35
  2.1 材料与方法  28-30
    2.1.1 供试虫源  28
    2.1.2 主要试剂和仪器  28
    2.1.3 vectorette PCR  28-29
      2.1.3.1 引物设计  28
      2.1.3.2 vectorette PCR 模板制备  28-29
      2.1.3.3 PCR 扩增  29
    2.1.4 克隆和测序  29
    2.1.5 靶标位点和插入特性分析  29-30
  2.2 结果与分析  30-33
    2.2.1 vectorette PCR 结果  30
    2.2.2 PgPLE1 侧翼序列同源性分析  30-32
    2.2.3 靶位点及其附近碱基的选择性偏好分析  32-33
  2.3 讨论  33-35
第三章转座子PGPLE1 转录和转座活性分析  35-47
  3.1 材料与方法  35-38
    3.1.1 供试虫源  35-36
    3.1.2 转录活性分析  36-38
      3.1.2.1 总RNA 提取  36
      3.1.2.2 第一链cDNA 的合成  36-37
      3.1.2.3 RT-PCR  37-38
      3.1.2.4 PCR 产物回收、纯化、克隆和测序  38
        3.1.2.4.1 PCR 产物回收、纯化  38
        3.1.2.4.2 克隆和测序  38
    3.1.3 转座活性分析  38
  3.2 结果与分析  38-45
    3.2.1 RT-PCR  38-39
    3.2.2 克隆和序列分析  39-44
    3.2.3 转座活性分析  44-45
  3.3 讨论  45-47
第四章转座子PGPLE1 种群插入多态性分析  47-56
  4.1 材料与方法  47-49
    4.1.1 供试虫源  47
    4.1.2 主要试剂和仪器  47
    4.1.3 基因组DNA 的提取  47-48
    4.1.4 插入多态性检测  48-49
    4.1.5 数据处理  49
  4.2 结果与分析  49-54
    4.2.1 PgPLE1 插入多态性检测  49
    4.2.2 基因型分布、插入基因频率及Hardy-Weinberg 平衡检验  49-50
    4.2.3 种群间遗传分化分析  50-53
    4.2.4 种群间遗传距离及系统发生树构建  53-54
  4.3 讨论  54-56
第五章棉红铃虫不同地理种群MT-DNA COⅠ  56-63
  5.1 材料与方法  56-58
    5.1.1 实验材料  56
    5.1.2 基因组DNA 提取  56
    5.1.3 PCR 扩增与测序  56-57
    5.1.4 序列分析  57-58
  5.2 结果与分析  58-62
    5.2.1 PCR 扩增结果  58
    5.2.2 序列组成分析  58
    5.2.3 序列变异和单倍型分布  58-60
    5.2.4 种群遗传多样性分析  60
    5.2.5 种群间遗传分化与遗传距离分析  60-61
    5.2.6 系统发生分析  61-62
  5.3 讨论  62-63
参考文献  63-77
致谢  77

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