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番茄耐热种质资源的筛选及苗期耐热相关基因的分离

作　者: 冯璐
导　师: 杨悦俭
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 番茄耐热坐果率叶绿素荧光参数电解质渗透率相关性基因差异表达
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

番茄(Lycopersicon esculentum Mill)是最重要的蔬菜作物之一,在人们生活中占有重要的地位。番茄是喜温植物,但不耐高温。长期高温逆境下生长,常伴随着产量、抗逆性、抗病性下降和商品性差等现象的发生。随着全球温室效应的增加,气候逐渐变暖,番茄耐热育种越来越受到了人们的重视,番茄耐高温研究已经成为当前番茄研究的一个热点。本文以10份番茄为材料,通过统计高温胁迫下坐果率筛选出耐热番茄和热敏感番茄各2份。测定这4份番茄材料的电解质渗透率和叶绿素荧光参数,筛选番茄耐热性鉴定指标；并通过cDNA-AFLP技术分离耐热相关基因,为番茄苗期耐高温研究奠定了基础,为番茄耐高温育种提供了理论依据。本论文的研究内容及结果如下：1、高温会造成花粉活力下降,从而影响授粉不良,受精过程紊乱,产生畸形果,甚至落花落果。因此,本实验通过统计高温胁迫下的番茄坐果率来衡量番茄高温耐受能力。本实验于2009年6-8月在浙江省农业科学院杨渡试验基地的温室大棚内进行。统计10份番茄材料不同时期的坐果率,发现’CLN-2413R’和‘05-161F2-1-13-0-0-0’坐果率较高,高于50%；而‘9246’和‘9185’坐果率较低,低于1%。坐果率与番茄的耐热性成显著正相关。2、以耐热番茄’CLN-2413R’、’05-161F2-1-13-0-0-0’和热敏感番茄‘9246’、‘9185’为材料,通过测定高温胁迫下苗期番茄电解质渗透率(EC)和相对电解质渗透率(EC%),并与高温胁迫下番茄坐果率进行相关性分析,发现高温胁迫下电解质渗透率(EC)与坐果率成显著负相关(|R|>0.95),较适合作为苗期番茄耐热性鉴定指标。3、利用FM-2便携式荧光仪测定上述4份番茄材料在高温胁迫下的叶绿素荧光参数(Fv’/Fm’、ΦPSⅡ、qP、Fv/Fm、Fv/FO、ETR),并与高温胁迫下坐果率进行相关性分析,结果发现：Fv’/Fm’、qP、Fv/Fm、Fv/FO、ETR与高温胁迫下的坐果率相关系数达到0.9以上(|R|>0.9),即相关性显著,可以用来辅助番茄耐热性的鉴定。4、应用cDNA-AFLP技术研究了高温胁迫下耐热番茄’CLN-2413R’和热敏感番茄‘9246’苗期叶片基因差异表达情况,共分离出12条与耐热相关的基因(耐热番茄’CLN-2413R’:3条；热敏感番茄‘9246’：9条)。通过BLAST比对,4条基因与番茄热传导系数有关；1条基因与真核生物中的荧光素酶同源性较高；1条基因是番茄染色体上的序列；2条基因是番茄苹果酸酶的序列；其余4条基因BLAST比对与已知序列没有较高的同源性。并利用实时荧光定量PCR技术分析基因的差异表达情况,结果表明：高温胁迫后’CLN-2413R’的基因表达水平普遍高于‘9246’,说明经高温胁迫后’CLN-2413R’耐热基因能够大量表达以此适应高温逆境。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
第一章文献综述  10-26
  1 番茄种植的现状  10
  2 番茄生长的温度及高温的危害  10-11
    2.1 番茄生长的适宜温度及高温对番茄的危害  10-11
    2.2 解决高温胁迫的途径  11
  3 番茄耐高温的研究进展  11-13
  4 耐高温番茄的鉴定方法  13-16
    4.1 田问自然鉴定法  13-14
    4.2 人工模拟鉴定法  14
    4.3 间接鉴定法  14-16
      4.3.1 微观结构指标  15
      4.3.2 生理生化指标  15-16
  5 热激蛋白  16-17
  6 本研究的目的与意义  17
  7 电解质渗透率  17-18
  8 叶绿素荧光参数  18-20
  9 cDNA-AFLP技术  20-21
  10 荧光定量PCR  21-26
    10.1 荧光定量PCR定义  21-22
    10.2 荧光定量PCR的优点  22
    10.3 荧光定量PCR的应用  22-23
    10.4 荧光定量PCR方法  23-26
      10.4.1 SYBR Green Ⅰ方法  23-24
      10.4.2 相对定量分析方法  24-26
第二章番茄耐热种质资源及耐热鉴定指标的筛选  26-37
  1 利用田间自然鉴定法筛选耐热和热敏感番茄材料  26-28
    1.1 实验材料与方法  26-27
      1.1.1 实验材料  26
      1.1.2 实验方法  26-27
    1.2 实验结果  27
    1.3 结果与讨论  27-28
  2 通过比较两种电解质渗透率方法来筛选番茄耐热鉴定指标  28-31
    2.1 实验材料与方法  28-29
      2.1.1 实验材料  28
      2.1.2 实验试剂与仪器  28
      2.1.3 实验方法  28-29
    2.2 实验结果  29-31
      2.2.1 两种方法测定耐热材料与热敏感材料的结果比较  29
      2.2.2 4份番茄材料两种电解渗透率结果与高温肋迫下坐果率的相关性分析  29-30
      2.2.3 结果与讨论  30-31
  3 通过测定叶绿素荧光参数筛选番茄耐热鉴定指标  31-37
    3.1 实验材料与方法  31
      3.1.1 实验材料  31
      3.1.2 实验方法  31
      3.1.3 实验试剂与仪器  31
    3.2 实验结果  31-36
      3.2.1 Fv'/Fm'  31-32
      3.2.2 ΦPSⅡ  32-33
      3.2.3 qP  33
      3.2.4 Fv/Fm  33-34
      3.2.5 Fv/F_0  34-35
      3.2.6 ETR  35
      3.2.7 相关性分析  35-36
    3.3 结果与讨论  36-37
      3.3.1 测定荧光参数实验应注意的问题  36
      3.3.2 小结  36-37
第三章番茄苗期耐热相关基因的分离  37-67
  1 利用cDNA-AFLP技术分离苗期番茄耐热相关基因  37-60
    1.1 实验材料与准备  37-40
      1.1.1 实验材料  37
      1.1.2 实验准备  37
      1.1.3 实验用的试剂和仪器  37-40
    1.2 实验方法  40-50
      1.2.1 植物叶片的RNA提取  40-41
      1.2.2 反转录cDNA的合成  41-42
      1.2.3 cDNA-AFLP方法  42-50
    1.3 cDNA-AFLP结果与分析  50-53
      1.3.1 番茄叶片总RNA的提取  50
      1.3.2 反转录成cDNA  50-51
      1.3.3 酶切、结果  51
      1.3.4 预扩增结果  51
      1.3.5 选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析  51-52
      1.3.6 cDNA差异片段的分离、回收与分析  52-53
    1.4 测序结果与分析  53-58
      1.4.1 测序结果和比对结果  53-57
      1.4.2 根据以上的测序结果设计了引物序列  57-58
    1.5 结果与讨论  58-60
      1.5.1 RNA的提取  58
      1.5.2 cDNA的合成  58
      1.5.3 酶切与连接  58
      1.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳  58-59
      1.5.5 小结  59-60
  2 利用荧光定量PCR技术对耐热相关基因的表达水平进行分析  60-67
    2.1 实验材料与准备  60
      2.1.1 实验材料  60
      2.1.2 实验准备  60
      2.1.3 实验用的试剂和仪器  60
    2.2 实验方法  60-62
      2.2.1 第一链cDNA的合成  60-61
      2.2.2 Realtime PCR反应  61-62
    2.3 实验结果与讨论  62-67
      2.3.1 actin筛选结果  62-63
      2.3.2 引物筛选结果  63-64
      2.3.3 荧光定量PCR结果  64-65
      2.3.4 小结  65
      2.3.5 荧光定量PCR过程中应该注意的问题  65-67
全文总结  67-68
参考文献  68-72
附录  72-74
致谢  74-76
攻读学位期间发表论文情况  76-77

番茄耐热种质资源的筛选及苗期耐热相关基因的分离

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