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朵丽蝶兰(Doritaenopsis hybrid)是朵丽兰(Doritis)与蝴蝶兰(Phalaenopsis)的杂交后代,其抽穗多、花期长、花色丰富,是目前商业应用最广泛的蝴蝶兰杂交种类之一。大部分热带兰成花主要受到光照和温度的影响,但相比之下,相对低温是热带兰成花最关键的诱导因子。成花‘温敏’现象已成为目前制约蝴蝶兰产业发展的重要因素,大大提高了生产成本。因此寻找降低经济成本和人工调控花期相结合的最佳方法,是我国蝴蝶兰产业发展的必然选择和趋势。本文以朵丽蝶兰(Doritaenopsis‘Tinny Tender’)克隆苗为材料,系统研究其不同温度(低温、高温)处理条件下开花情况,用构建差减文库的方法筛选出与‘温敏’现象相关的基因,并进行克隆和分析其表达特性,取得的主要研究结果如下:1.详细记录了朵丽蝶兰在相对高温和低温环境下的成花情况:结果表明,与大部分兰科植物一样,朵丽蝶兰成花过程具有‘温敏’现象,即花芽分化过程对低温的特殊要求。在低温处理组中,处理第4周时发现了第一个花梗突起生成;第8周时已有部分花蕾形成;而5个月之后,低温处理组中100%的植株开花。然而,高温处理组(30/25℃)中的植株在这整个过程中始终是处理营养生长状态。实验说明了朵丽蝶兰(Doritaenopsis hybrid)与其亲本蝴蝶兰(Phalaenopsis orchid)一样,成花过程中需要低温诱导。2.为了解这一过珵的分子机制,采用抑制差减杂交技术(SSH),构建以朵丽蝶兰在低温(22℃/18℃)(Tester)和高温(30℃/25℃)(Driver)条件下处理40d的表达基因差减文库:差减库容为2,373个克隆,重组率达95%,经去冗除杂分析一共得到高质量序列1,540个。序列分析表明,差减文库中的unigene参与新陈代谢的占到17.7%,其次为环境刺激应答9%;参与信号途径的基因为7.65%;运输途径2.4%;参与发育过程的占到1.71%;细胞定位1.1%;基因功能分析过程中发现开花计时基因GIGANTEA (GI)、泛素化相关基因、Zn2+结合蛋白和蔗糖合成酶基因等,并将这些基因功能分析整理成数据库。3.通过RACE技术从朵丽蝶兰中克隆到GI基因,并命名为DhGI1。该基因完整cDNA序列,全长为4,022bp,5’端有308bp的非转录区,3’端有220bp的非转录区和polyA尾巴,编码1,161个氨基酸。该基因的cDNA序列已提交到GenBank,登陆号为:HQ388416。同源性分析结果显示,DhGI1基因与水稻、玉米、小麦、拟南芥中的GI基因所编码的氨基酸序列都有着极高的相似度。4.半定量RT - PCR显示,DhGI1在朵丽蝶兰的整个发育阶段的各个组织中都能被检测到,包括根,茎,叶,花梗和花蕾。在低温诱导环境下,植株转向生殖生长阶段,该基因在各组织中的表达水平明显高于营养生长阶段(包括幼苗期和高温处理组的成熟期)。进一步分析表明,DhGI1的表达量在经过低温诱导后明显增加;而在高温下(30/25℃)的条件,DhGI1基因的表达量一直处于低水平,而且花芽分化受到抑制。以上结果表明,DhGI1表达受低温诱导,且与花芽分化密切相关,因此该基因可能在低温诱导朵丽蝶兰开花过程中起到关键的作用。对该基因进一步研究,如超量表达或敲除,将有助于确认DhGI1在蝴蝶兰从营养生长到生殖生长的转化过程中的功能,并初步揭示兰科植物的开花机理。在工业生产中,通过基因工程手段对DhGI1(如转基因技术)基因加以应用,将为减少朵丽蝶兰,甚至其它蝴蝶兰的生产成本提供新的方法。文库的初步筛选分析表明,差减文库中包含了‘温敏’现象的相关候选基因,并为后续的蝴蝶兰成花‘温敏’机理的研究提供了基础以及技术平台。
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