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EGF联合NS398对猫角膜内皮冷冻损伤的修复作用

作　者: 王琼
导　师: 丁明星
学　校: 华中农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: TGF-β2 NS398 EGF 角膜内皮细胞猫
分类号: S858.293
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

角膜内皮损伤愈合不良造成角膜混浊和水肿,影响了人的视力,损害了人的身心健康。而人的角膜内皮难以修复,与其它动物(如兔和牛)的内皮细胞能通过有丝分裂促进愈合不同,人、猫和灵长类的细胞有丝分裂能力受房水中TGF-β2抑制,细胞只能通过有限的移行和扩大来填补内皮层受损区,严重的损伤常导致愈合不良。对此,我们将促内皮生长的因子EGF和抗TGF-β2的药物NS398按一定比例分别在猫的体外和体内联合使用,了解它们促内皮层愈合的效率。并在这个过程中,检测TGF-β2的信号蛋白Smad2、内皮肌纤维母细胞的标志蛋白a-SMA和新生内皮细胞的标志蛋白PCNA含量变化。以了解它们促进内皮细胞的再生和减轻内皮层混浊的机理。体外培养猫的角膜内皮细胞,先用MTT法检测不同浓度的TGF-β2对角膜内皮增殖的抑制效果。再将最佳浓度的TGF-β2添加到培养基中,模拟猫体内角膜内皮细胞的生长抑制环境,检测不同浓度的EGF和NS398对受抑制细胞的促增殖效果。最后检测EGF和NS398合用促细胞增殖的最佳浓度以及作用时间。体内建立猫的角膜内皮冷冻损伤模型。以左眼为对照组,右眼为EGF和NS398联合给药组,用免疫组化的方法比较两眼中Sa-SMA和PCNA的含量变化,用台盼蓝-茜素红染色检测并比较二者内皮层的愈合状况。试验结果表明：TGF-β2剂量依赖性的抑制猫角膜内皮细胞增殖,最佳抑制浓度为10ng/mL。无论内皮细胞是否受TGF-β2抑制,EGF的促增殖最佳浓度均为10ng/mL,在10ng/mL TGF-β2、10ng/mLEGF的细胞生长环境中,NS398促增殖最佳浓度为5umol/mL,而且其促增殖效率在第三天达到顶点。将10ng/mL EGF和5umol/mL NS398在猫的角膜内皮冷冻损伤模型的药物组中联合使用,能有效提高内皮层的愈合效率。修复过程中,相同时间内药物组中未被修复的内皮层面积远低于对照组,到第7天,药物组中的内皮细胞基本覆盖了整个内皮层。各项愈合指标均优于对照组,显示了良好的促愈合趋势。对照组中的Smad2和a-SMA含量远高于药物组,而PCNA的含量比药物组低。通过试验可以得出：10ng/mLTGF-β2体外抑制猫内皮细胞增殖后,10ng/mL EGF和5umol/mL NS398联合给药能显著提高内皮细胞的增殖效率。最佳的作用周期为3天。在体内,药物组NS398能通过降低Smad2的含量,阻断TGF-β2的Smad信号途径,消除了TGF-β2对内皮细胞增殖周期的抑制和促肌纤维母细胞转化的作用。使得药物组新生细胞标志蛋白PCNA的含量高于对照组,而肌纤维母细胞的标志蛋白a-SMA的含量降低。另外,EGF促进内皮细胞移行,与NS398联合使用加快了内皮细胞愈合的速率。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表  10-11
1 前言  11-24
  1.1 文献综述  11-22
    1.1.1 角膜内皮的损伤  11-13
    1.1.2 角膜内皮的再生  13-15
    1.1.3 TGF-β的化学结构和生物学效应  15-17
    1.1.4 TGF-β的信号通路与角膜愈合  17-21
    1.1.5 TGF-β抑制剂的研究  21-22
  1.2 研究内容和目标  22-23
  1.3 研究的目的和意义  23-24
2. 材料与方法  24-29
  2.1 主要的仪器设备  24
  2.2 主要的药品和试剂  24-26
  2.3 猫角膜内皮的体外实验  26-27
    2.3.1 猫角膜内皮的原代培养和鉴定  26-27
    2.3.2 猫角膜内皮细胞增殖观察  27
  2.4 EGF和NS398合用对猫角膜内皮损伤的修复实验  27-29
    2.4.1 实验动物与分组  27-28
    2.4.2 角膜内皮冷冻损伤模型的制备  28
    2.4.3 NS398和EGF在角膜前房中联合使用  28
    2.4.4 角膜免疫组织切片与观察  28
    2.4.5 台盼蓝与茜素红联合染色检测内皮愈合情况  28-29
    2.4.6 统计分析  29
3 结果与分析  29-41
  3.1 原代角膜的培养鉴定结果  29-31
  3.2 TGF-B2、EGF和NS398对角膜内皮的增殖影响  31-35
  3.3 各物质免疫组化结果观察  35-37
  3.4 内皮愈合情况的统计  37-41
4 讨论  41-48
  4.1 猫角膜内皮细胞的体外培养  41-42
  4.2 猫角膜内皮冷冻损伤模型的建立  42-43
  4.3 NS398和EGF联合使用促进角膜内皮愈合  43-48
5 结论  48-49
参考文献  49-57
附录  57-69
致谢  69

EGF联合NS398对猫角膜内皮冷冻损伤的修复作用

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