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饲用酵母菌的分离与鉴定及复合微生态制剂的研制

作　者: 王鹏
导　师: 邓昌彦
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 微生态制剂酵母菌液体发酵冷冻干燥喷雾干燥
分类号: S816.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

如今在畜牧业的生产过程中,动物促生长及疾病的防治很大程度上还是依赖于抗生素,可是抗生素带来的负面影响也是日益突出,因此寻求新的、安全的制剂来取代抗生素已经成为一种现实的需要。微生态制剂是通过改善宿主肠道菌群平衡而发挥益生作用的生物制剂,是实现安全、无污染、无药物残留的绿色畜产品的重要途径。本次试验一共分离出8株酵母菌,并利用26S rDNA基因D1/D2区序列分析法对其酵母菌进行了鉴定,得到了6株饲用酵母和2株毛孢子菌。对其中的一株酿酒酵母进行了生物学特性的研究。分别研究了酵母菌和枯草芽孢杆菌的发酵工艺,以及这两株菌与乳酸菌的混合发酵工艺。优化了冷冻干燥、喷雾干燥和烘干干燥三种工艺,并探讨了三种工艺的优劣。具体结果如下：(1)酿酒酵母50L发酵罐发酵条件为：接种量为5%(1.5L),发酵温度设为30℃,通气量为1.3 Nm3/h,搅拌速度为180rpm,添加3%泡敌,1%的豆油做消泡剂。在此条件下,发酵28小时,酿酒酵母活菌数为1.42×1011cfu/ml.(2)采用单因素试验和正交试验的方法确立了枯草芽孢杆菌的最佳发酵培养基配方为：蔗糖2%、豆粕2%、NaCl 0.1%、MgSO40.02%、MnSO40.005%、KH2PO4\K2HPO40.3%：0.1%、0.02% CaCl2；发酵罐培养条件为：装液量为60%、3L、接种量为1%、初始pH为7.0、温度30℃、转速180rpm、通气比在1：0.3-0.5。在此条件下进行的5L发酵罐发酵,活菌数可以达到5.3×1012cfu·mL-1。(3)根据各菌种间的协同关系,初步确定了不同菌种混合发酵的工艺,发酵条件为：接种量为5%,发酵温度为35℃,转速为180rpm,接种次序为先接种酿酒酵母和乳酸菌,再接枯草芽孢杆菌。(4)酵母菌的冷冻干燥保护剂以脱脂奶粉10%+麦芽糊精5%为最佳,活菌数达到9.31×1010cfu/ml,存活率为65.6%；乳酸菌和枯草芽孢杆菌以脱脂奶粉10%+蔗糖10%为最佳活菌数分别为1.44×1011cfu/ml和1.52×1011cfu/ml,存活率分别为68.6%和82.6%。(5)喷雾干燥的进风温度为160℃,出口温度为77℃,以5%脱脂奶粉作为保护剂,制出的菌粉细腻,不发粘效果较好。各菌剂干燥结果为：酿酒酵母活菌数6.25×1010cfu/ml,存活率为44.0%；乳酸菌活菌数1.16×1011fu/ml,存活率为55.2%；枯草芽孢杆菌活菌数为1.15×1011cfu/ml,存活率为62.5%。

全文目录

摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
第一章文献综述  12-22
  1.1 微生态制剂的概念及发展历程  12
  1.2 微生态制剂所用菌种和分类  12-17
    1.2.1 乳酸菌类微生态制剂  13-14
    1.2.2 芽孢杆菌类微生态制剂  14-15
    1.2.3 酵母菌类微生态制剂  15-16
    1.2.4 霉菌类微生态制剂  16
    1.2.5 光和细菌类微生态制剂  16
    1.2.6 复合型微生态制剂  16-17
  1.3 微生态制剂的发酵工艺  17-19
    1.3.1 固体发酵法  17
    1.3.2 液体发酵法  17-18
    1.3.3 发酵条件  18-19
      1.3.3.1 发酵培养基  18
      1.3.3.2 发酵物理条件  18-19
    1.3.4 发酵条件的优化  19
  1.4 微生态制剂的制粒工艺  19-20
    1.4.1 冷冻干燥技术  19-20
    1.4.2 喷雾干燥技术  20
    1.4.3 包埋技术  20
  1.5 微生态制剂存在问题及应用前景  20-22
研究目的和意义  22-23
第二章饲用酵母菌的分离与鉴定  23-32
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 主要设备及仪器  23
    2.1.2 缓冲液和常用试剂的配置  23
    2.1.3 培养基  23-24
  2.2 试验方法  24-26
    2.2.1 样品中酵母菌的分离及鉴定  24-26
      2.2.1.1 酵母菌的分离与纯化  24-25
      2.2.1.2 酵母菌总DNA的提取  25
      2.2.1.3 酵母菌26S rDNA D1/D2区的PCR扩增  25-26
      2.2.1.4 序列测定  26
    2.2.2 酵母菌的功能性测定  26
      2.2.2.1 酵母菌的耐酸性  26
      2.2.2.2 耐胆盐试验  26
      2.2.2.3 酵母菌死灭温度的测定  26
  2.3 试验结果  26-31
    2.3.1 酵母菌的分离  26-27
    2.3.2 酵母菌的鉴定  27-29
      2.3.2.1 酵母菌的形态特征  27-28
      2.3.2.2 酵母菌26S rDNA D1/D2区的鉴定  28-29
    2.3.3 啤酒酵母菌特性的初步研究  29-31
      2.3.3.1 耐酸性  29-30
      2.3.3.2 耐胆盐性  30
      2.3.3.3 酿酒酵母的耐温性  30-31
  2.4 讨论  31-32
    2.4.1 酵母菌的鉴定方法  31
    2.4.2 酿酒酵母的功能性探讨  31-32
第三章益生菌发酵条件的优化  32-45
  3.1 试验材料  32-33
    3.1.1 菌株  32
    3.1.2 仪器设备  32
    3.1.3 培养基  32-33
  3.2 试验方法  33-36
    3.2.1 酵母菌发酵工艺  33-34
      3.2.1.1 啤酒酵母生长曲线的绘制  33
      3.2.1.2 酵母菌发酵温度的确定  33
      3.2.1.3 工艺流程  33
      3.2.1.4 酵母菌活菌数的测定  33-34
    3.2.2 枯草芽孢杆菌发酵工艺  34-35
      3.2.2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线的绘制  34
      3.2.2.2 最佳培养温度的确定  34
      3.2.2.3 最佳初始pH值的确定  34
      3.2.2.4 不同培养基成分对芽孢杆菌液体发酵的影响  34-35
      3.2.2.5 影响芽孢形成率的无机离子配方的L_9(3~4)正交设计  35
      3.2.2.6 检测方法  35
      3.2.2.7 枯草芽孢杆菌发酵罐培养  35
    3.2.3 混合发酵发酵工艺  35-36
      3.2.3.1 菌种培养  35
      3.2.3.2 发酵罐小试培养  35-36
  3.3 结果与分析  36-43
    3.3.1 酿酒酵母发酵结果  36-37
      3.3.1.1 酿酒酵母生长曲线  36
      3.3.1.2 酿酒酵母发酵温度  36-37
      3.3.1.3 酿酒酵母的发酵结果  37
    3.3.2 枯草芽孢杆菌发酵结果  37-43
      3.3.2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线  37
      3.3.2.2 枯草芽孢杆菌最佳培养温度  37-38
      3.3.2.3 枯草芽孢杆菌最适pH值  38
      3.3.2.4 碳源对菌体生长的影响  38-39
      3.3.2.5 氮源对菌体生长的影响  39
      3.3.2.6 无机盐对菌体生长的影响  39
      3.3.2.7 菌株培养基配方的L_9(3~3)正交试验  39-40
      3.3.2.8 影响芽孢形成率的无机离子配方的L_9(3~4)正交设计  40-42
      3.3.2.9 发酵罐小试发酵结果  42-43
    3.3.3 混合发酵结果  43
  3.4 讨论  43-45
第四章微生态制剂的干燥工艺  45-50
  4.1 试验材料  45
    4.1.1 材料  45
    4.1.2 主要试剂  45
    4.1.3 仪器设备  45
  4.2 试验方法  45-46
    4.2.1 冷冻干燥工艺  45
    4.2.2 喷雾干燥工艺  45-46
    4.2.3 烘干干燥工艺  46
    4.2.4 菌粉中活菌数的测定  46
    4.2.5 活菌制剂的保存实验  46
  4.3 结果与分析  46-49
    4.3.1 冷冻干燥保护剂实验结果  46-47
    4.3.2 喷雾干燥结果  47-48
    4.3.3 烘干干燥结果  48
    4.3.4 制剂的保存期  48-49
  4.4 讨论  49-50
第五章结语  50-52
  5.1 结论  50
  5.2 展望  50-52
参考文献  52-57
附录 (获得的酵母菌的26S rDNA基因DI/D2区序列)  57-60
致谢  60

饲用酵母菌的分离与鉴定及复合微生态制剂的研制

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