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肝癌血清潜在标志物Clusterin的质谱鉴定及细胞组织验证

作　者: 李茵
导　师: 何敏
学　校: 广西医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 高丰度蛋白肝癌血清标志物 iTRAQ MALDI-TOF-MS Clusterin
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肝癌是我国最常见和最具有危害性的恶性肿瘤之一。目前肝癌发病率在我国呈逐步上升趋势,其死亡率在我国占恶性肿瘤死亡的前列。高危人群有数千万,但很多患者治疗时已属晚期,究其原因是缺乏特异性高的早期诊断方法。甲胎蛋白(AFP)是众所皆知的肝癌生物标志物,与细胞数量以及癌细胞的分化有着密不可分的关系,不过目前却有资料显示,20%-30%的肝癌患者AFP检测为阴性,或仍然处于相对低水平的状态。除此以外,AFP的增高还可见于别的疾病(如：恶性畸胎瘤、肝血管瘤、慢性肝炎、肝硬化等)。虽然目前很多医院结合AFP与超声检查大大提高了肝癌的检出率,但还是有大约20%的肝癌患者被漏诊,以至于错过了最佳治疗时间。因此,探求新的对肝癌敏感特异的血清标志物,并寻找新的实验室诊断模式,是目前临床有待解决的难题。相对和绝对定量的等量异位标签(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。有研究证明,iTRAQ标记技术是研究细胞或组织的不同生理状态,比较正常和病理状态下蛋白质组异同的一种有效方式。寻找和发现区别于正常生理状态下的疾病特异蛋白质标志物,有利于阐明疾病的发病机理,对疾病的预防、诊断、预后和疗效监测具有积极作用,并有助于作为新靶点开发临床治疗药物。基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF/MS)是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱,己成为检测和鉴定多肽、多糖、核苷酸、蛋白质、高聚物、糖蛋白以及多种合成聚合物的强有力的工具,也是目前蛋白质组研究中最有力的工具。而基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF-TOF/MS)是最新型的生物质谱技术,和单级的MALDI-TOF/MS相比,MALDI-TOF-TOF/MS精确度更高,信息量更广。本课题的研究目的在于,应用iTRAQ标记技术和MALDI-TOF-TOF生物质谱技术鉴定肝癌患者血清差异表达蛋白,并在肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞HL-7702,肝癌组织和癌旁组织中验证肝癌潜在标志物Clusterin的表达水平。第一章乙腈、乙醇、色谱柱去除血清高丰度蛋白方法的比较目的：比较乙腈沉淀法、乙醇沉淀法和多重亲和去除色谱柱Human14法去除人血清中高丰度蛋白的效果。方法：应用乙腈沉淀法、乙醇沉淀法和多重亲和去除色谱柱Human14法对血清样品进行处理,Bis-Tris Mini Gels电泳和双向凝胶电泳检测去除高丰度蛋白的效果。结果：从一维胶电泳图灰度值分析,血清经过乙腈法、多重亲和去除色谱柱Human14、乙醇处理后,白蛋白条带灰度值由原血清的19分别变成157.2,40.8,8.2；从2-DE电泳图分析看出,多重亲和去除色谱柱Human14法处理后的蛋白点数显著增多,比原血清增加了137个；乙腈法和乙醇法处理后虽然蛋白点减少了,却有低丰度蛋白质点显现出来。结论：乙腈沉淀法能在去除血清中高丰度蛋白的同时收获更多的10kD以下的小分子量蛋白；乙醇沉淀法能去除部分高丰度蛋白,但小分子量蛋白的收获量较少；而多重亲和去除色谱柱Human14法也能有效地去除血清中高丰度蛋白的干扰,且保留了大量的小分子量蛋白。第二章血清Cluster in的质谱鉴定及验证实验目的鉴定肝癌患者血清差异表达蛋白并在肝癌细胞和组织中验证肝癌潜在标志物Clusterin的表达水平。方法运用iTRAQ标记结合LC-MALDI-TOF/TOF串联质谱技术,分析20例肝癌患者与20例健康对照的血清中差异蛋白的表达水平；用质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)定性验证血清Clusterin; Real-time RT-PCR检测潜在标志物Clusterin在肝癌细胞和正常肝细胞,30对肝癌和癌旁组织中mRNA表达水平；Western blot检测Clusterin在肝癌细胞中表达水平。结果iTRAQ结合质谱分析共发现显著差异表达蛋白51个,其中Clusterin在肝癌患者血清中表达下调；MRM技术验证Clusterin12对母子离子对真实存在；Real-time RT-PCR发现,Clusterin在肝癌细胞中的mRNA表达水平比在正常肝细胞中表达低20倍,在肝癌组织中的mRNA表达水平比在癌旁组织中表达低2.38倍；Western blot检测Clusterin在肝癌细胞和正常肝细胞中的平均光密度值分别为8.06和27.81(P<0.01),在肝癌细胞中的表达明显降低。结论Clusterin在肝癌血清、细胞和组织中的mRNA表达水平和在肝癌细胞中表达水平均为下调,其与肝癌的关系值得进一步研究。

全文目录

主要縮略语  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-15
第一章乙腈、乙醇、色谱柱去除血清高丰度蛋白方法的比较  15-30
  前言  15-16
  材料与方法  16-22
  结果  22-25
  讨论  25-27
  参考文献  27-30
第二章血清Clusterin的质谱鉴定及验证  30-71
  前言  30-34
  材料与方法  34-51
  结果  51-59
  讨论  59-64
  参考文献  64-71
综述  71-81
  参考文献  78-81
致谢  81-82
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  82

肝癌血清潜在标志物Clusterin的质谱鉴定及细胞组织验证

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