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半夏内生菌Pseudomonas Aeruginosa pY11T-3-1生防效果及活性成分分析

作　者: 董飞
导　师: 胡秀芳；竺锡武
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: P. aeruginosa pY11T-3-1 生物防治温室及田间试验活性成分
分类号: S435.672
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)是天南星科的一种重要的传统药用植物。生物防治是预防半夏等中药材病害的首选方法。本论文针对栽培半夏中发病较高的软腐病,对前期所分离的半夏高效内生菌——铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) pY11T-3-1进行初步应用研究,并探索活性成分的分离纯化及初步鉴定方法。首先,对生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1进行了植株软腐病防治、促生长和室内安全生测等试验。结果,生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1可在半夏、番茄、白菜等植物中稳定定殖,并有效抑制这些植物的软腐病发生,生防效果在80%以上。促生长试验表明生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1对3种植物的发芽率、发芽势、株高、鲜重及日增长量具有一定的促进作用。室内安全性生测结果表明,高浓度生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1抑制植物生长,中低浓度则促进植物生长。可见,适宜浓度的生防菌对植物不仅安全无害,而且还具有一定的促进作用,在实际生产中具有较好的应用潜力。其次,初步优化了生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1活性成分产生的最佳条件。单因子发酵条件试验表明,生防菌发酵产生活性成分的最佳条件为:140ml装液量、pH 7.0发酵液、10%接种量、30℃培养24-48h。按照此条件,成功地在发酵罐培养了P. aeruginosa pY11T-3-1。耐受性检测表明,该菌的生防活性成分对高温、碱性环境的耐受性较强,冷冻干燥和真空干燥对其活性影响较小。因此,可采用冷冻干燥对发酵液进行干燥浓缩。最后,探索了生防菌的分离、纯化及鉴定方法。膜与理化分离结果表明,PW4040F型超滤陶瓷膜可有效地对生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1发酵液中的活性成分进行分离,其对发酵液中杂质截留量及膜清洗后通量恢复率分别为89.5%、92.9%;DK4040F型纳滤膜对超滤液中的活性成分的效价进一步浓缩,浓缩倍数为,浓缩液的含固率为1.81%;乙酸乙酯则可对该菌的活性成分进行高效萃取。可见,膜分离和溶剂萃取菌可用于活性成分的初步分离,膜分离适用于大量制备,乙酸乙酯萃取适用于小规模操作。对以上初步分离物进行纯化与初步鉴定。薄层层析结果表明,正己烷:乙酸乙酯(85:15)的分离效果最佳,分离条带为3-5条。用此溶剂系统,对粗提物ASW进行硅胶柱分离,获得具有抑菌活性的分离物ASW20-30,其中分离物ASW20的抑菌活性最强。高效液相色谱分析发现,用甲醇:水(=70:30)作流动相,分离物ASW20可以进行较好地分离,获得2个主峰,峰面积分别为42.2%、36.71%;质谱鉴定,相应地得到2个主峰ASN206和ASN207,其保留时间分别为46.20 min、6.77 min,相对分子量分别为259、271,结合文献初步确定分离物ASN206和ASN207分别为吡咯特林(pyoluteorin)和吡咯尼群(pyrronitrin)。此外,尚可确定分子量的产物9种,对于这些物质的特性有待进一步分析。综上所述,兼具促生和防病双重功效的安全生防菌,P. aeruginosa pY11T-3-1在实际生产中具有潜在的应用开发价值,生所建立的分离、纯化及初步鉴定方法对该菌的应用研究提供了理论依据。

半夏内生菌Pseudomonas Aeruginosa pY11T-3-1生防效果及活性成分分析

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