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以前列腺干细胞抗原为靶点的重组蛋白及重组腺病毒载体疫苗的研究

作　者: 董磊
导　师: 陈薇; 于长明
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: PSCA HSP70 前列腺癌 疫苗
分类号: R392.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


基于本课题前期关于以PSCA(Prostate stem cell antigen, PSCA)为靶点的前列腺癌治疗性DNA疫苗的研究结果,本研究拟选取人源的热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)作为佐剂分子,构建用于前列腺癌治疗用的重组亚单位疫苗及重组腺病毒载体疫苗,期望能够利用HSP70分子的佐剂功能和分子伴侣功能增强PSCA蛋白的可溶性和免疫后机体的免疫水平;同时基于“prime-boost”免疫策略的考虑,希望不同疫苗的联合免疫能够明显提高机体的免疫水平。通过在小鼠前列腺癌模型上系统地检测不同疫苗的免疫水平,评价以PSCA作为治疗靶点的疫苗的免疫效果,为前列腺肿瘤疫苗的研制及临床研究奠定基础。为构建重组亚单位疫苗,通过对PSCA进行结构分析,保留其活性结构域的部分,然后将PSCA、HSP70基因分别克隆至原核表达载体pET21a(+)质粒中,构建重组表达质粒pET21-PSCA-HSP。SDS-PAGE电泳分析表明PSCA-HSP在E.coli中得到可溶性表达。为了评价重组亚单位疫苗的免疫效果,在大肠杆菌系统中表达了PSCA、HSP70及PSCA-HSP重组蛋白,并经过色谱层析技术获得了具有一定纯度的重组蛋白。免疫C57BL/6雄性小鼠后,通过上述技术方法检测了针对PSCA的细胞免疫和体液免疫水平,并观察小鼠的肿瘤生长情况及死亡时间。研究结果表明,免疫重组蛋白PSCA-HSP能够激起PSCA特异的细胞免疫反应;PSCA、PSCA+HSP及PSCA-HSP免疫组均能诱导机体产生较高的针对PSCA的抗体,三组之间的抗PSCA抗体水平没有差异;HSP、PSCA+HSP及PSCA-HSP免疫组均诱导机体产生了较高水平的针对HSP的抗体,三组之间的抗体水平没有差异;免疫PSCA、PSCA+HSP及PSCA-HSP均能抑制小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的存活时间,其中PSCA-HSP的抗肿瘤效果要优于其它两组。为构建重组腺病毒载体疫苗,将PSCA基因从实验室保存的质粒pcDNA-PSCA中酶切获得,将PSCA-HSP融合基因从实验室保存的质粒pcDNA-PSCA-HSP中酶切获得,分别克隆至pDC316质粒中,构建重组穿梭质粒pDC316-PSCA及pDC316-PSCA-HSP,将重组穿梭质粒进行腺病毒包装,制备重组腺病毒Ad5-PSCA及Ad5-PSCA-HSP。为了评价重组腺病毒载体疫苗的免疫效果,免疫C57BL/6雄性小鼠后,通过ELISPOT、胞内细胞因子检测和ELISA等手段检测了针对PSCA的细胞免疫和体液免疫水平,并观察小鼠的肿瘤生长情况及死亡时间。研究结果表明,免疫Ad5-PSCA及Ad5-PSCA-HSP均能够激起机体强烈的PSCA特异的细胞免疫反应,但是各组针对PSCA的抗体效价水平均较低;免疫Ad5-PSCA及Ad5-PSCA-HSP均能抑制小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的存活时间,其中Ad5-PSCA-HSP的抗肿瘤效果要优于Ad5-PSCA。基于“prime-boost”免疫策略,本研究将以PSCA为靶点的重组腺病毒载体疫苗以及重组亚单位疫苗联合免疫C57BL/6雄性小鼠,通过上述各项免疫指标的检测比较不同疫苗的细胞及体液免疫水平,并观察小鼠的肿瘤生长情况及死亡时间。研究结果表明,各免疫组均能激起PSCA特异的细胞及体液免疫反应;各免疫组均能抑制小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的存活时间,其中Ad5-PSCA-HSP+PSCA-HSP混合免疫方式获得了最佳的抗肿瘤效果。本研究构建了基于PSCA为靶点的重组腺病毒载体疫苗及重组亚单位疫苗,并在小鼠前列腺肿瘤模型上评价了不同疫苗的免疫效果,为前列腺肿瘤疫苗的研制及临床研究奠定基础。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
引言  10-18
第一部分 HSP70 与PSCA 重组融合蛋白的表达及纯化  18-34
  1 实验材料与方法  18-24
  2 结果  24-31
  3 讨论  31-34
第二部分 PSCA-HSP70 重组融合蛋白在小鼠肿瘤动物模型上的免疫效果评价  34-46
  1 材料与方法  34-37
  2 结果  37-43
  3 讨论  43-46
第三部分 重组腺病毒载体疫苗的构建及在小鼠肿瘤动物模型上的免疫效果评价  46-60
  1. 实验材料与方法  46-51
  2. 结果  51-57
  3. 讨论  57-60
第四部分 不同疫苗的联合免疫在小鼠肿瘤动物模型上的免疫效果评价  60-68
  1. 实验材料与方法  60-61
  2. 结果  61-66
  3. 讨论  66-68
结论  68-70
参考文献  70-74
附录一 主要溶液的配制  74-78
附录二 主要缩略语表  78-80
附录三 实验主要仪器  80-82
综述  82-88
  参考文献  86-88
论著  88-94
个人简历  94-96
致谢  96-97

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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