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微小隐孢子虫部分含TSP1结构域蛋白对上皮细胞的粘附特性研究

作　者: 张静
导　师: 尹继刚
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 微小隐孢子虫 TSP1结构域黏附 Cell blot Western blotting、亲和ELISA
分类号: R382.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

隐孢子虫（Cryptosporidium）是世界范围内医疗界和兽医界公认的重要肠道寄生虫，可以导致人类和动物的隐孢子虫病。其中微小隐孢子虫（C.parvum）的感染对人畜健康威胁最大。该病在健康人群中引起自限性腹泻疾病，但免疫缺陷的人群感染该病后病情严重甚至危及生命。目前研制开发相关抗体和疫苗的阻碍主要在于缺少对微小隐孢子虫致病机理的了解。宿主细胞表面受体和寄生虫表面配体通过相互作用来调节微小隐孢子虫粘附和侵入宿主细胞膜，这是由数个复杂的过程构成，它涉及了多种寄生虫分子和宿主分子。为了掌握隐孢子虫病隐性感染的机制并制定治疗隐孢子虫病的策略，我们必需知晓这些过程的分子机制。在顶复门其它寄生原虫中，含TSP1样结构域的蛋白在虫体粘附侵入宿主细胞中发挥重要的作用，经过对微小隐孢子虫基因组序列的筛选，含TSP1结构域的基因共有12种，这些基因都含有信号肽序列及1个或多个TSP1样结构域，另外还包含其他参与细胞间相互作用的结构域，如Kringle、表皮生长因子、Apple结构域，特别是目前诸多的研究结果都暗示TSP家族中TRAP-C1蛋白与微小隐孢子虫的粘附密切相关。虽然微小隐孢子虫的TSP家族蛋白的功能还不确定，微小隐孢子虫与顶复门其他寄生虫TRAP家族蛋白序列的同源性和结构的相似性暗示微小隐孢子虫TSP家族蛋白可能也参与侵入宿主细胞的过程。本实验选择CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10四种蛋白进行研究。从基因库中选取目的基因片段进行原核表达，并通过Western blotting、亲和ELISA、Cell blot3种方法检测以上4种重组蛋白对上皮样细胞是否具有粘附作用。根据GenBank上CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10的基因序列设计引物，经过PCR扩增后得到CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10目的基因片段的大小分别为420bp、587bp、603bp和897bp。将目的片段连接在pMD18-T载体上，对构建的克隆载体鉴定、测序正确后，将目的片段克隆在表达载体上，再将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。对构建的四种表达载体鉴定、测序及比对。经过表达温度条件的比较和不同温度下重组蛋白可溶性的比较后选择最佳表达条件，经0.1mmol/L IPTG诱导菌体大量表达后超声破菌，从而获得可溶性表达产物，对目的蛋白质用Gluthathione-Sepharose4B磁珠进行纯化，经SDS-PAGE和Western blot鉴定rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10，相对分子量分别为41KDa、47KDa、45KDa、58KDa，与预计的分子量大小相符。以纯化的rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10为抗原，采用抗原与弗氏佐剂混合乳化的方式免疫BALB/c小鼠，从而制备多克隆抗体。将4种蛋白分别与Caco-2细胞、HCT-8细胞、MDBK细胞共孵育后，通过Westernblotting检测到rGST-TSP6和rGST-TSP8能结合上述3种细胞，而GST蛋白不结合。通过细胞亲和ELISA的方法测定4种重组蛋白对3种细胞的结合，发现rGST-TSP6和rGST-TSP8与3种细胞的结合与对照组GST蛋白相比差异显著（P<0.05），且在一定浓度范围内呈现剂量依赖性。通过非变性凝胶电泳将4种重组蛋白转移到NC膜上，再与3种悬浮细胞共孵育后，通过氨基黑染色发现rGST-TSP6和rGST-TSP8可以与3种细胞结合，同时，该结合可以被针对蛋白质的多克隆抗体阻断。表明该结合具有特异性。因此，TSP家族中的CpTSP6和CpTSP8蛋白参与了微小隐孢子虫与宿主细胞的黏附过程。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-12
前言  12-14
第一篇文献综述  14-28
  第一章微小隐孢子虫粘附相关蛋白研究进展  14-28
    1.1 隐孢子虫简介  14-16
    1.2 微小隐孢子虫主要的粘附相关蛋白  16-27
    1.3 结语  27-28
第二篇研究内容  28-78
  第一章微小隐孢子虫 TSP6、TSP7、TSP8、 TSP10 基因的克隆及表达  28-56
    1.1 材料  28-31
    1.2 方法  31-42
    1.3 结果  42-52
    1.4 讨论  52-55
    1.5 小结  55-56
  第二章 HCT-8、Caco-2、MDBK 三种上皮细胞的培养  56-60
    2.1 材料  56-57
    2.2 方法  57-58
    2.3 结果  58
    2.4 讨论  58-59
    2.5 小结  59-60
  第三章 rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10 对三种上皮细胞系粘附特性的研究  60-78
    3.1 材料  60-62
    3.2 方法  62-66
    3.3 结果  66-74
    3.4 讨论  74-76
    3.5 小结  76-78
结论  78-79
参考文献  79-89
导师简介  89-90
作者简介  90
攻读硕士学位期间取得的成果  90-91
致谢  91

微小隐孢子虫部分含TSP1结构域蛋白对上皮细胞的粘附特性研究

内容摘要

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