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呼吸道合胞病毒感染小胶质细胞活化Toll样受体3、7介导炎性反应的初步研究

作　者: 李振兴
导　师: 黄升海
学　校: 安徽医科大学
专　业: 微生物学
关键词: 呼吸道合胞病毒 Toll样受体3 Toll样受体7 小胶质细胞 NF-κB TNF-α
分类号: R373.14
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的探讨呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）感染小胶质细胞（BV2）后，Toll样受体3（Toll-like receptor3, TLR3）和Toll样受体7（Toll-like7receptor, TLR7）水平的变化，初步研究TLR3和TLR7介导产生的下游炎性因子在神经系统病毒感染中表现出的炎性反应，为临床RSV感染中枢神经系统的预防和治疗提供新的思路。方法（1）RSV感染体外培养的BV2，免疫荧光法分12、24、和36h检测RSV融合蛋白（F蛋白），观察RSV是否可以感染BV2。（2）分别于感染4、8、12、16、24、和36h收集细胞，以未感染细胞作为对照组。用Trizol提取细胞总RNA，半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测TLR3、TLR7的mRNA表达量的变化。（3）免疫印迹法（Western-blot）检测RSV感染4、8、12、16、24、和36h核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)蛋白水平的变化，以未感染细胞作为对照组。（4）酶联免疫吸附法（ELISA）检测感染不同时间点细胞上清中TNF-α含量的变化，以未感染细胞作为对照组。结果（1）免疫荧光结果显示，和阴性对照比较，RSV感染BV2后12、24、36h可见在DAPI染色对照的细胞部位均可以见FITC标记RSV-F蛋白的绿色荧光，而阴性对照未见。并且该荧光呈增强趋势，有时间依赖性，。（2）RT-PCR法测定结果显示，正常组中TLR3、TLR7mRNA转录水平较低，而在RSV感染组，随着感染时间增加TLR3、TLR7mRNA转录水平不断提高。感染后4、8、12、16、24、36h不同时点感染组TLR3、TLR7mRNA转录水平均高于正常组，差异均有统计学意义，且在感染组中TLR3、TLR7mRNA转录水平有随时间延长而呈升高趋势，各时点间差异有统计学意义。（3）Western blot法测定结果显示，正常组中NF-κB蛋白水平表达量较低，而在RSV感染组，随着感染时间增加NF-κB表达不断上调。感染后4、8h升高未见统计学意义，而从12、16、24、36h，各时点感染组NF-κB蛋白表达水平均高于正常组，差异均有统计学意义（P<0.01），且在感染组中，NF-κB蛋白表达水平有随时间延长而呈升高趋势，各时点间差异有统计学意义。（4）ELISA法的检测结果显示，正常组中TNF-α含量较低，而在RSV感染组，随着感染时间增加TNF-α含量不断提高。感染后4、8、12、16、24、36h，不同时点感染组TNF-α含量均高于正常组，差异均有统计学意义（P<0.01），且在感染组中，TNF-α含量有随时间延长而呈升高趋势，各时点间差异有统计学意义。结论RSV可以感染中枢神经系统内小胶质细胞BV2，活化TLR3、TLR7后诱导NF-κB的上调，从而使下游细胞炎性因子TNF-α分泌升高，过度的炎性反应可能与神经系统症状的发生相关。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1. 前言  12-14
2. 材料与方法  14-28
  2.1 材料  14-15
    2.1.1 病毒和细胞  14
    2.1.2 试剂  14-15
    2.1.3 仪器和设备  15
  2.2 方法  15-27
    2.2.1 溶液的配制  15-17
    2.2.2 RSV 增殖及感染量测定  17-18
    2.2.3 细胞模型建立和实验分组  18-19
    2.2.4 免疫荧光法检测 RSV-F 蛋白在 BV2 细胞内表达  19-20
    2.2.5 TLR3,TLR7 在 RSV 感染组 mRNA 转录水平的检测  20-22
      2.2.5.1 BV2 细胞总 RNA 提取  20
      2.2.5.2 RNA 定性与定量分析  20-21
      2.2.5.3 两步 RT-PCR 方法检测  21-22
      2.2.5.4 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果  22
    2.2.6 BV2 细胞内 NF-κB 蛋白的 Western blot 检测  22-26
      2.2.6.1 总蛋白样本的制备  22-23
      2.2.6.2 Lowry 法蛋白定量  23-24
      2.2.6.3 蛋白免疫印迹（western blot）法检测 NF-κB 的蛋白表达  24-26
    2.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测 TNF-α在细胞上清中含量  26-27
  2.3 统计学分析  27-28
3. 结果  28-35
  3.1 R S V 毒力的测定  28
  3.2 RSV 感染 BV2 后 CPE 的观察  28-29
  3.3 RSV 感染 BV2 免疫荧光检测  29-30
  3.4 TLR3、TLR7 在 RSV 感染组 mRNA 转录水平检测结果  30-32
    3.4.1 TLR3 mRNA 在各组不同时间点的表达结果  30-31
    3.4.2 TLR7 mRNA 在各组不同时间点的表达结果  31-32
  3.5 BV2 细胞 NF-κB 的蛋白水平变化结果  32-34
  3.6 BV2 细胞上清中 TNF-α含量的变化结果  34-35
4. 讨论  35-40
5. 结论  40
参考文献  40-46
附录  46-47
致谢  47-48
综述  48-58
  参考文献  55-58

呼吸道合胞病毒感染小胶质细胞活化Toll样受体3、7介导炎性反应的初步研究

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