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Pyk2在小鼠卵子受精及早期胚胎发育过程中的定位研究

作　者: 代元元
导　师: 刘树真; 孟小倩
学　校: 山东师范大学
专　业: 动物学
关键词: Pyk2 受精早期胚胎发育定位细胞增殖
分类号: R321
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

Pyk2是一种非受体酪氨酸激酶，属于粘着斑家族中的成员，与FAK有密切关系，是一种进化上非常保守的蛋白质。Pyk2在不同的细胞中与不同的分子相互作用，从而发挥不同的作用。目前，对于Pyk2的研究主要集中在体细胞中，并且在体细胞中的功能具有多样性；它可以感受包括细胞外基质在内的多种物理和化学的细胞外信号而激活，参与胞内信号传递，从而在细胞粘附、迁移、生存、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用。但Pyk2在生殖细胞中的功能研究很少。本实验室曾研究了Pyk2在大鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的定位及功能，发现Pyk2可能通过调节微丝的聚合与组装在大鼠卵母细胞极性的建立、第一极体排出过程中发挥重要作用。另有研究发现，Pyk2参与癌细胞的增殖和迁移，成为目前癌症治疗的靶点。哺乳动物早期胚胎发育过程的细胞分裂类似癌细胞的增殖，因此，Pyk2可能也在这一过程中发挥重要作用，但是，目前未见相关研究和报道。本研究应用蛋白印迹、共聚焦显微术、抑制剂干扰等方法对Pyk2在成熟卵子中的表达和其在小鼠卵子受精及早期胚胎发育过程中的定位进行了研究，为进一步了解其功能奠定基础。研究发现在小鼠卵母细胞受精过程中，无论是体内受精还是体外受精取出的受精卵，Pyk2除了均匀分布在细胞质中外，还特异性地聚集在精子头部及形成的雌雄原核中；在小鼠体内取出和体外培养的早期胚胎中，Pyk2均匀地分布在细胞质中，此外还特异性地聚集在细胞核除核仁之外的区域，包括分散在核中的染色质上，也可见Pyk2的分布。在分裂期的卵裂球中，染色质凝集为染色体，此时Pyk2也呈点状分布在染色体上。从体内取出的较晚期的囊胚中，Pyk2在细胞核中消失，主要分布在细胞与细胞的连接处，只有少数细胞中，还可见细胞质中有Pyk2的表达。而较多的Pyk2聚集在囊胚滋养层细胞外的空隙中。另外，我们进一步研究了第402位酪氨酸磷酸化的Pyk2（P-Pyk2）在小鼠早期胚胎发育过程中的定位分布情况，结果发现在体内的早期胚胎发育过程中几乎检测不到P-Pyk2的分布，只有在早期胚胎3-细胞、4-细胞和桑葚胚中有少量的Pyk2被活化，并呈星点状分布在细胞质中。而在体外培养的早期胚胎中只有在2-细胞胚胎中检测到较明显的P-Pyk2分布，而且只分布在细胞与细胞的接触处；4-细胞、桑葚胚和早期囊胚中，可见少量P-Pyk2呈星点状分布在胞质中。为了研究Pyk2可能具有的功能，用不同浓度（2.5μmol/L、1.25μmol/L、1μmol/L、0.8μmol/L、0.625μmol/L）的酪氨酸激酶抑制剂Tyrphostin A9处理体外培养的受精卵，发现Tyrphostin A9能够抑制受精卵的卵裂，但是这种抑制并不是呈浓度依赖性，而是呈现全或无的特征，既当抑制剂浓度大于1μmol/L时，卵裂即被抑制，而当抑制剂浓度小于0.8μmol/L时，虽然其卵裂率与对照组之间呈显著性差异，但大部分受精卵的卵裂则不受影响。另外，通过检测抑制的受精卵在Pyk2的分布变化，发现Pyk2表达明显上升。令人吃惊的是，Tyrphostin A9不仅没有抑制Pyk2的磷酸化，反而显著增加了第402位酪氨酸的磷酸化，通过检测对抑制剂处理后仍可以正常卵裂的2-细胞胚胎中P-Pyk2的定位变化发现，其表达量显著增加，不仅在整个胞质都有分布，而且在细胞核中还有特异性聚集。这些结果说明受精卵在有抑制剂Tyrphostin A9的环境下，通过激活Pyk2来维持自身的早期胚胎发育的。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
文献综述  10-30
  综述 1 酪氨酸激酶 Pyk2 研究进展  10-22
    1.1 Pyk2 的表达和定位  10
    1.2 Pyk2 的结构  10-13
      1.2.1 Pyk2 结构域和相互作用分子  10-11
      1.2.2 Pyk2 和 FAK 的结构异同与相互作用的分子  11-12
      1.2.3 Pyk2 的异构体  12-13
    1.3 Pyk2 的抑制剂策略  13-15
      1.3.1 催化区域抑制剂  13-14
      1.3.2 Pyk2 非催化区抑制剂  14-15
    1.4 Pyk2 的功能  15-22
      1.4.1 参与细胞内信号传递  15-16
      1.4.2 Pyk2 和细胞迁移、细胞粘附  16-17
      1.4.3 Pyk2 在癌症发生和迁移中的作用  17-20
      1.4.4 Pyk2 与心血管疾病密切相关  20-21
      1.4.5 Pyk2 其他功能研究  21-22
  综述二小鼠受精卵早期胚胎发育过程中的分子机制研究  22-30
    2.1 与受精相关的分子变化  23-24
    2.2 与原核形成相关的分子  24-25
    2.3 与小鼠合子型基因激活相关的分子  25-26
    2.4 1 细胞向 2 细胞转化相关的分子  26-27
    2.5 与早期胚胎发育相关的分子  27-29
    2.6 与小鼠胚胎着床相关的分子  29-30
实验研究 Pyk2 在小鼠卵子受精及早期胚胎发育过程中的定位研究  30-47
  1 材料与方法  30-34
    1.1 实验动物  30
    1.2 药品与试剂  30
    1.3 实验仪器：  30-31
    1.4 实验方法  31-34
      1.4.1 超数排卵和 MII 期卵子的收集  31
      1.4.2 体外受精  31-32
        1.4.2.1 精子的获取  31
        1.4.2.2 授精及观察  31-32
      1.4.3 体内受精卵及胚胎的收集  32
      1.4.4 体内受精卵的体外培养  32
      1.4.5 Pyk2 免疫荧光标记  32-33
      1.4.6 Western-blot  33
      1.4.7 酪氨酸激酶抑制剂 Tyrphostin A9 处理  33-34
      1.4.8 统计假设检验  34
  2 实验结果  34-44
    2.1 Pyk2 在小鼠成熟卵母细胞中的表达  34
    2.2 Pyk2 在小鼠体外受精卵中的亚细胞定位  34-35
    2.3 Pyk2 在小鼠体内受精卵中的亚细胞定位  35-37
    2.4 Pyk2 在小鼠早期胚胎体外发育过程中的亚细胞定位  37-38
    2.5 Pyk2 在体内发育的小鼠早期胚胎中的亚细胞定位  38-39
    2.6 P-Pyk2 在体内发育的小鼠早期胚胎中的亚细胞定位  39-40
    2.7 P-Pyk2 在小鼠早期胚胎体外发育过程中的亚细胞定位  40-41
    2.8 不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂 Tyrphostin A9 处理对小鼠胚胎卵裂的影响  41-42
    2.9 酪氨酸激酶抑制剂 Tyrphostin A9 处理后 Pyk2 和 P-Pyk2 的定位  42-44
  3 讨论  44-47
参考文献  47-57
缩略语表  57-58
攻读硕士学位期间发表的论文  58-59
致谢  59

Pyk2在小鼠卵子受精及早期胚胎发育过程中的定位研究

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