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何首乌饮减轻Aβ诱导的海马神经元损伤作用机制的研究

作　者: 郭胜男
导　师: 丁良; 牛嗣云
学　校: 河北大学
专　业: 药理学
关键词: β-淀粉样蛋白何首乌饮海马神经元阿尔茨海默症硫氧还蛋白
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，随着当今世界人口的老龄化，AD发病率日益增高，世界上有3500多万人患有阿尔茨海默病，并且患者的死亡率日益增加，因此有关此病的研究成为国内外的热点之一。阿尔茨海默病其病理特征表现为神经细胞内出现神经纤维缠结（过度磷酸化的Tau蛋白是其主要成分）以及细胞外存在老年斑，且主要分布在前皮质和海马区。老年斑的主要成分是Aβ（β-淀粉样蛋白），是由β淀粉样前体蛋白（AmyloidprescursorproteinAPP）被β位点APP裂解酶剪切所生成，Aβ是AD患者发病的和病程进展的主要因素，聚合态的Aβ可导致神经细胞凋亡。细胞凋亡是海马神经元损伤的主要因素，已有研究表明以何首乌为主药组成的多种中成药对大鼠的学习记忆有保护作用，广泛用于抗衰老。但何首乌饮对Aβ诱导的海马神经元损伤的保护作用机制尚未见报道。目的：探讨何首乌饮对Aβ诱导的大鼠原代培养海马神经元损伤保护作用及可能机制。方法：1.采用新生24h内的SD大鼠进行原代培养海马神经元2.将培养10d的海马神经元分为以下五组：模型组：神经元培养8d后，在培养液中加入终浓度为10μmol/L的Aβ_1-40培养48h；何首乌饮保护组：神经元培养6d后，在培养液中加入10%的何首乌饮含药血清，预处理48h，再加入终浓度为10μmol/L的Aβ_1-40培养48h；何首乌饮治疗组：神经元培养6d后，再加入终浓度为10μmol/L的Aβ_1-40培养48h，再在培养液中加入10%的何首乌饮含药血清，处理48h；何首乌饮对照组：神经元培养8d后，10%的何首乌饮含药血清培养48h;空白对照组：神经元培养10d，不做任何处理。3.采用台盼蓝染色观察海马神经元存活率的变化：死细胞被染成蓝色，活细胞不着色，用未染色活细胞总数在总细胞数中所占百分比来评价何首乌饮对Aβ诱导的海马神经元存活率的作用。4.采用Hoechst33258染色观察海马神经元的凋亡率：海马神经元培养10d后进行Hoechst33258染色，在荧光显微镜下观察细胞的核染情况，随机选取10个视野，计数细胞凋亡率。5.检测各组海马神经元Trx1的表达情况：免疫组化染色观察Trx1的表达；用RT-PCR检测各组Trx1的mRNA表水平，并用Westernblot检测各组Trx1蛋白的水平。结果：1.细胞形态改变空白对照组和何首乌饮对照组神经元生长旺盛，胞体大，边界清楚，突起长，分枝连接呈网状；与正常组比较，模型组细胞贴壁不牢，失去原有形态，胞体肿胀，细胞膜破裂，周围有许多细胞碎片，突起大部分断裂成断线状；何首乌饮治疗组和预防组细胞状态与模型组相比较神经元的胞体较为完整，大部分细胞有突起，且突起间有联接。2.细胞存活率的变化台盼蓝染色观察模型组存活率与空白对照组比较明显降低（P<0.05），何首乌饮治疗组和预防组与模型组比较存活率明显增高（P<0.05），何首乌饮治疗组和预防组与空白对照组比较没有显著性差异（P>0.05），何首乌饮治疗组和预防组比较也没有显著性差异（P>0.05）。3.Hoechst33258染色与空白对照组比较，模型组的凋亡率明显增加（P<0.05），与模型组比较，何首乌饮治疗组和预防组的凋亡率明显降低（P<0.05）。何首乌饮治疗组和预防组与空白对照组比较没有显著性差异（P>0.05），何首乌饮治疗组和预防组比较也没有显著性差异（P>0.05）。4.细胞免疫染色结果Trx1阳性物质呈棕色，位于细胞质。染色结果显示与空白对照组比较，模型组Trx1的表达明显降低（P<0.05）；与模型组比较，何首乌饮治疗组和预防组Trx1表达明显升高（P<0.05）,与空白组比较，何首乌饮治疗组和预防组Trx1的表达明显升高（P<0.05），何首乌饮治疗组和何首乌饮预防组比较Trx1表达没有显著性差异（P>0.05）。5.Trx1蛋白和mRNA表达结果何首乌饮治疗组、何首乌饮预防组明显高于模型组（P<0.05），模型组明显低于空白对照组（P<0.05），治疗组和预防组之间没有差异（P>0.05），空白对照组和何首乌饮组之间也没有明显差异（P>0.05）。结论：1.何首乌饮能减轻Aβ诱导的海马神经元的凋亡，对Aβ致海马神经元的损伤有保护作用。2.何首乌饮能增加由Aβ诱导的海马神经元的存活率。3.何首乌饮能通过增加Trx1蛋白的表达对海马神经元起保护作用。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-14
第1章文献综述  14-23
  1.1 阿尔茨海默病的发病机理  14-16
    1.1.1 淀粉样蛋白级联假说  14
    1.1.2 Tau 蛋白学说  14-15
    1.1.3 免疫学说  15-16
  1.2 阿尔茨海默病的中医药治疗  16-17
  1.3 何首乌对 A D 保护作用  17-18
  1.4 小结与展望  18-19
  参考文献  19-23
第2章材料和方法  23-35
  2.1 实验材料  23-24
    2.1.1 主要试剂  23
    2.1.2 主要仪器设备  23-24
    2.1.3 实验动物  24
  2.2 实验方法  24-35
    2.2.1 实验试剂和材料的准备  24-25
    2.2.2 海马神经元的培养  25-26
    2.2.3 神经元纯度的鉴定  26-27
    2.2.4 何首乌饮对海马神经元保护作用实验分组  27
    2.2.5 Hoechst 33258 染色  27
    2.2.6 台盼蓝染色  27
    2.2.7 免疫组化 SP 法  27-28
    2.2.8 RT-PCR 法检测 Trx1 的表达  28-30
    2.2.9 Western Blotting  30-34
    2.2.10 统计学处理  34-35
第3章结果  35-42
  3.1 大鼠海马神经元原代培养形态性特点及鉴定  35-37
    3.1.1 海马神经元形态学观察  35-36
    3.1.2 神经元纯度的鉴定  36-37
  3.2 台盼蓝染色观察细胞死亡率  37
  3.3 Hoechst 33258 染色  37-39
  3.4 细胞免疫组化染色 Trx1 的表达结果  39-40
  3.5 RT-PCR 和 Western Blotting 结果  40-42
第4章讨论  42-47
  4.1 β-淀粉样蛋白的神经毒性作用  42-43
  4.2 AD 与神经元凋亡的关系  43
  4.3 硫氧还蛋白与 AD 的关系  43-45
  4.4 何首乌饮在 AD 中的可能保护作用机制  45-47
参考文献  47-49
致谢  49-50
攻读硕士期间取得的学术成果  50

何首乌饮减轻Aβ诱导的海马神经元损伤作用机制的研究

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