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hOGG1基因在Cr（Ⅵ）诱导L-02肝细胞线粒体DNA氧化损伤中的作用

作　者: 李鹏
导　师: 钟才高
学　校: 中南大学
专　业: 公共卫生与预防医学
关键词: 六价铬 活性氧簇 线粒体DNA 8-羟基脱氧鸟苷hOGG1基因 抗氧化酶系统
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：在体外试验系统,初步探讨Cr(Ⅵ)诱导线粒体DNA氧化损伤情况及hOGGl基因的修复作用,为进一步阐明Cr(Ⅵ)诱导线粒体氧化损伤的机制提供线索。方法：以L-02肝细胞为受试细胞,通过MTT试验检测不同浓度Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞存活率的影响,筛选出Cr(Ⅵ)浓度高(32umol/L)、中(8μmol/L)、低(2μmol/L)和空白对照(0μmol/L)进行后续试验,染毒时间为24h。通过多功能荧光酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)及ATP的浓度,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测hOGG1基因mRNA的表达,酶标仪检测线粒体内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western blot方法检测线粒体内8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(hOGG1蛋白)含量,分光光度计检测细胞内过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。结果：1.Cr(Ⅵ)引起L-02肝细胞存活率降低：Cr(Ⅵ)在2-256μmol/L处理浓度范围内(处理24h),能明显引起L-02肝细胞存活率的降低(P<0.05),处理浓度和细胞存活率之间存在明显负相关(r=-0.924,P<0.01)。根据细胞存活率选出适当的Cr(Ⅵ)处理浓度：高(32μmol/L)、中(8μmol/L)、低(2μmol/L)和空白对照(0μmol/L)进行后续试验。2.Cr(Ⅵ)引起L-02肝细胞活性氧簇(ROS)含量增加：与对照组比较,2μmol/L Cr(Ⅵ)处理浓度组细胞内ROS平均含量无明显增加(p>0.05),8、32μmol/L Cr(Ⅵ)处理组细胞内ROS平均含量逐渐增加(p<0.05),且随着Cr(Ⅵ)处理浓度的增大,细胞内ROS平均含量随之增加,两者之间存在明显正相关(r=0.942,P<0.01)。3.Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞能量代谢的影响：与对照组相比,2μmol/LCr(Ⅵ)低浓度组细胞内ATP浓度无变化(p>0.05);8、32μmol/LCr(Ⅵ)浓度组细胞内ATP浓度明显降低(P<0.05),且随着Cr(Ⅵ)处理浓度的增大,细胞内ATP浓度随之降低,两者之间存在明显负相关(r=-0.967,P<0.05)。4.Cr(Ⅵ)对线粒体内8-OHdG含量的影响：与对照组相比,2μmol/L Cr(VI)低浓度组线粒体内8-OHdG平均含量无变化(p>0.05)；8、32μmol/LCr(VI)浓度组线粒体内8-OHdG平均含量明显降低(P<0.05),且随着Cr(Ⅵ)处理浓度的增大,线粒体内8-OHdG含量随之增加,两者之间存在明显正相关(r=0.816,P<0.05)。5.Cr(Ⅵ)对hOGG1基因表达的影响：与对照组相比,2μmol/L处理组hOGG1基因mRNA表达水平及线粒体内hOGG1蛋白含量均明显增加(p<0.05)；8μmol/L浓度组hOGG1基因mRNA表达水平及线粒体内hOGG1蛋白含量与对照组相比无明显改变(p>0.05),但低于2μmol/L处理组(p<0.05);32μmol/L浓度组两者均明显降低(p<0.05),且在2-32μmol/L Cr(VI)处理浓度范围内,hOGG1基因mRNA表达水平及线粒体内hOGG1蛋白含量逐渐降低。6.Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞抗氧化酶活力的影响：与对照组相比,2μmol/L浓度组细胞内SOD、CAT和GSH-PX平均活力明显增加(p<0.01);8μmol/L浓度组细胞内SOD和CAT平均活力明显降低(p<0.01),细胞内GSH-PX平均活力明显升高,且高于2μmol/L浓度组(p<0.01);32μmol/LCr(VI)浓度组细胞内SOD、CAT和GSH-PX平均活力均明显降低。结论：Cr(Ⅵ)可诱导细胞内ROS水平增加,使mtDNA受到氧化损伤,线粒体内8-OHdG含量增加,影响ATP的产生,导致细胞发生能量代谢障碍。而hOGG1基因表达水平及抗氧化酶活力(SOD、CAT和GSH-PX)的改变,影响了线粒体DNA的修复。总之,hOGG1基因在Cr(Ⅵ)诱导线粒体DNA氧化损伤中起到了重要的作用。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
英文缩略表  11-13
第一章 前言  13-17
第二章 材料与方法  17-27
  2.1 材料  17-19
    2.1.1 受试细胞  17
    2.1.2 主要试剂  17
    2.1.3 主要试剂溶液的配制  17-18
    2.1.4 主要仪器  18-19
  2.2 方法  19-27
    2.2.1 试验技术路线  19
    2.2.2 肝细胞培养  19
    2.2.3 肝细胞生存率检测  19-20
    2.2.4 细胞内活性氧(ROS)含量检测  20
    2.2.5 细胞ATP含量检测  20-21
    2.2.6 线粒体内8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量检测  21-22
    2.2.7 hOGG1基因表达水平的检测  22-24
    2.2.8 细胞内SOD、CAT、GSH-PX活力检测  24-26
    2.2.9 统计分析  26-27
第三章 结果  27-35
  3.1 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞存活率的影响  27
  3.2 Cr(Ⅵ)诱导L-02肝细胞ROS的产生  27-28
  3.3 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞ATP浓度的影响  28-29
  3.4 Cr(Ⅵ)对线粒体内8-OHdG含量的影响  29-30
  3.5 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞hOGG1基因表达的影响  30-32
  3.6 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞抗氧化相关酶的影响  32-33
  3.7 hOGG1基因表达、线粒体内8-OHdG含量、细胞内ROS含量、ATP浓度、抗氧化酶活性和细胞存活率之间的相关性  33-35
第四章 讨论  35-41
  4.1 Cr(Ⅵ)所致hOGG1基因表达改变与线粒体DNA氧化损伤的关系  35-36
  4.2 Cr(Ⅵ)所致线粒体DNA氧化损伤与能量代谢障碍的关系  36-38
  4.3 Cr(Ⅵ)所致抗氧化酶活力改变与线粒体DNA氧化损伤的关系  38-41
第五章 结论  41-42
参考文献  42-47
综述  47-58
  参考文献  53-58
致谢  58-59
研究生期间的成绩  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 卫生基础科学 > 卫生毒理
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