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海水鱼类主要弧菌基因芯片检测技术的优化

作　者: 闫丽
导　师: 蒋继志; 黄倢
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 弧菌地高辛荧光素生物素基因芯片优化
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

弧菌病是世界范围内对海水养殖业造成严重经济损失的鱼类疾病,主要由鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻胶弧菌和哈维氏弧菌等引起。各种致病弧菌的检测方法有很多,免疫学检测如间接荧光抗体技术的灵敏度一般可达到每克鱼组织106个细菌,核酸杂交灵敏度可以达到150pg。基因芯片检测技术是高通量、微型化和自动化的新型分子生物学技术,是研究基因功能的有力工具。基因芯片的片基材料有很多种,可以采用玻片、硅片、金属片或者尼龙膜等；基因芯片的制备检测方法也各有不同。采用尼龙膜作为芯片片基进行杂交时步骤繁琐,杂交信号不稳定。因此,对海水鱼类主要弧菌基因芯片检测技术进行优化,并将该技术应用于水产动物病害监测,进行快速有效的早期诊断对防治工作来说是很重要的。利用基因特异性引物加入地高辛标记的dUTP扩增目的片段,然后与膜芯片进行杂交,对点样探针浓度、杂交时间和洗膜时间进行了优化,并对优化后条件的特异性进行了验证。实验结果显示所选鳗弧菌的6个毒力相关基因探针,在探针浓度为50μmol/L时,经过杂交显色即可得到清晰的显色信号,节约了探针的成本；杂交时间为30min时各点样点显色清晰,背景干扰小,大大节约了杂交时间；减少2个洗膜步骤,缩短45min的洗膜时间后,芯片杂交显色结果清晰；对优化后条件进行特异性实验的结果表明,按照优化后的洗膜步骤进行洗膜,各个样点之间无非特异性显色,显色结果可靠。对平整、厚薄均匀的25mm×76mm大小的载玻片分别进行氨基化和醛基化处理后,制备了玻片芯片,然后用基因特异性引物加入地高辛标记的dUTP扩增产物与玻片芯片进行杂交,对探针点样浓度,水合时间进行优化。氨基片实验结果表明,探针浓度为3.13μmol/L时,即可得到清晰的显色信号；探针水合时间为16h时,探针固定效果最好,杂交信号清晰可见。醛基片的杂交显色结果显示,各点均有阳性信号,但显色不很清晰。用正向引物带有荧光素HEX标记的基因特异性引物扩增目的片段,产物配制成杂交液与醛基玻片进行杂交。实验结果显示其中8个毒力相关基因均能特异性的显色,没有其他交叉反应,可以作为菌株是否含有该毒力基因的检测方法、以及作为菌株是否致病的重要参考指标。而所选各弧菌的16SrRNA,以及副溶血弧菌的hsp基因,都会与其他弧菌的16SrRNA、hsp发生交叉反应,其反应信号不能作为菌种准确鉴定的依据。实验中溶藻胶弧菌的16SrRNA在PCR反应中能很好的扩增出单一的目的条带,但在杂交信号中没有出现明显的荧光信号。实验中哈维氏弧菌的pap6和hemo基因,以及副溶血弧菌的trh基因,未能扩增出目的条带,因这些基因有菌株特异性,实验菌株可能不是具有该基因的菌株。实验证明,醛基玻片在结合16SrRNA、hsp和毒力相关基因共同组成的图谱中,能够准确鉴定出鳗弧菌,溶藻胶弧菌,副溶血弧菌,费氏弧菌和灿烂弧菌等5种弧菌。用正向引物带有生物素标记的基因特异性引物扩增目的片段,PCR产物配制成杂交液与醛基玻片进行杂交,杂交后的醛基片再与链亲和素包被的磁珠进行二次杂交。实验结果显示,所选鳗弧菌的5个毒力相关基因在PCR反应中能很好的扩增出单一的条带,但在两次杂交后只有鳗弧菌的angM有显色反应,而其他4个基因没有出现显色反应。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-22
  1.1 基因芯片技术的概况  12-15
    1.1.1 基因芯片的概念与原理  12-13
    1.1.2 基因芯片的制备  13-14
    1.1.3 基因芯片的杂交与杂交信号检测  14-15
  1.2 基因芯片技术的应用  15-20
    1.2.1 生命科学领域中的应用  15-16
    1.2.2 基因芯片技术在医学领域的应用  16-18
    1.2.3 基因芯片在水产病害检测中的应用  18-20
  1.3 展望  20-22
第二章鱼类鳗弧菌6个毒力基因膜芯片检测条件的优化  22-31
  2.1 材料与方法  22-25
    2.1.1 菌种来源及引物探针的合成  22-23
    2.1.2 细菌总DNA的提取  23
    2.1.3 地高辛标记PCR产物的制备  23-24
    2.1.4 膜芯片的制备及探针浓度的优化  24
    2.1.5 膜芯片杂交与洗膜条件的优化  24-25
    2.1.6 膜芯片洗膜条件优化后的特异性实验  25
  2.2 结果  25-29
    2.2.1 鳗弧菌6个毒力基因地高辛标记PCR扩增  25-26
    2.2.2 探针浓度的优化  26-27
    2.2.3 膜芯片杂交时间的优化  27
    2.2.4 杂交后洗膜时间的优化  27-28
    2.2.5 膜芯片洗膜条件优化后的特异性显色结果  28-29
  2.3 讨论  29-31
第三章鱼类鳗弧菌6个毒力基因地高辛标记扩增的玻片芯片检测技术的构建  31-37
  3.1 材料与方法  31-32
    3.1.1 玻片的选择和处理  31
    3.1.2 氨基修饰玻片的制备  31
    3.1.3 醛基修饰玻片的制备  31
    3.1.4 氨基芯片的制备  31-32
    3.1.5 醛基芯片的制备  32
    3.1.6 玻璃芯片的杂交与检测  32
  3.2 结果  32-34
    3.2.1 氨基片上不同点样探针浓度显色结果  32-33
    3.2.2 6个毒力基因水合不同时间的杂交显色结果  33-34
    3.2.3 醛基片杂交显色结果  34
  3.3 讨论  34-37
第四章鱼类主要弧菌毒力基因生物素和荧光素标记的玻片芯片检测技术的构建  37-47
  4.1 材料与方法  37-41
    4.1.1 仪器与试剂  37
    4.1.2 菌种及引物探针的合成  37-38
    4.1.3 细菌总DNA的提取  38
    4.1.4 目的序列荧光素标记的PCR扩增  38-39
    4.1.5 目的序列生物素标记的PCR扩增  39
    4.1.6 醛基芯片的制备  39
    4.1.7 杂交与检测  39-41
  4.2 结果  41-45
    4.2.1 用带有荧光素标记的基因特异性引物同步PCR扩增目的序列  41
    4.2.2 用带有生物素标记的基因特异性引物同步PCR扩增目的序列  41-42
    4.2.3 醛基芯片上点样探针点阵示意图  42
    4.2.4 醛基芯片检测6种弧菌  42-44
    4.2.5 醛基片检测鳗弧菌5个基因的生物素标记PCR扩增目的序列  44-45
  4.3 讨论  45-47
结论  47-48
参考文献  48-52
附录一  52-55
附录二  55-56
致谢  56-57

海水鱼类主要弧菌基因芯片检测技术的优化

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