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罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究

作　者: 庞碧剑
导　师: 吴灶和; 简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 罗非鱼抗体水平 ASC 体外增殖免疫记忆
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本研究以罗非鱼（Tilapia,Oreochromis Niloticus）为研究对象，对其进行腹腔二次注射外源性蛋白—人IgG后，分离其头肾、脾脏及外周血淋巴细胞进行体内外检测罗非鱼免疫应答。罗非鱼首次及二次免疫后，利用酶联免疫斑点（Enzyme-Linked Immunosorbentspot,ELISPOT）技术检测其头肾、脾脏和外周血中特异性抗体分泌细胞（antibody secretingcell,ASC）的分布以及用ELISA检测血清中抗体水平，发现首次免疫1d后可在头肾中检测出ASC；头肾、外周血以及脾脏中的ASC都在第12d达到最大值，头肾中的ASC数量要显著大于外周血及脾脏的ASC数量；血清中的抗体也在第12d达到最大值。二次免疫后检测到罗非鱼的头肾、血液和脾脏中ASC数量达到最大值的时间均比首次免疫最大值时间要提前3d，头肾、外周血及脾脏中ASC数量的最大值分别是首次免疫最大值的2倍、4倍和6倍以上，头肾中ASC的数量仍是3种组织中最多的，说明头肾是ASC及抗体的主要来源，并且是鱼类免疫应答的主要器官；二次免疫血清抗体水平显著高于首次免疫。从各组织中ASC增殖的倍数以及血清中增加的抗体水平来看，罗非鱼的二次免疫比首次免疫更快速，效率更高，证明罗非鱼具有的免疫记忆。体外培养罗非鱼淋巴细胞，MTT检测发现受免罗非鱼头肾、脾脏和外周血淋巴细胞在抗原人IgG刺激下均有不同程度增殖，其中外周血淋巴细胞的增殖是三者中最显著的，其次是头肾，而脾脏淋巴细胞对抗原刺激的反应不明显；用ELISPOT技术检测发现在未加入抗原条件下，头肾中ASC体外存活的时间比脾脏和外周血中ASC存活的时间长，而且培养液中抗体水平持续增加，说明头肾中的ASC属于长寿命浆细胞（Long-liveplasma,LPC）；而脾脏和外周血ASC属于短寿命浆细胞（Short-live plasma,SPC）；加入抗原人IgG后并没有看到明显的ASC增殖，而且由于抗原抗体的中和作用，3种组织淋巴细胞的ASC数量迅速减少，相应抗体水平检测也说明外源性蛋白抗原在体外对淋巴细胞无刺激增殖作用；加入非特异性抗原LPS刺激后，3种组织中的ASC均有明显增殖，第5d达到最大值，其中外周血中ASC增殖的倍数显著高于头肾和脾脏，说明外周血中存在较多的浆母细胞，能在LPS刺激下转化增殖为特异性ASC。本研究分析了罗非鱼首次和二次特异性免疫应答，建立了罗非鱼淋巴细胞体外刺激后增殖转化实验的基础数据，进一步研究了罗非鱼B淋巴细胞的体外增殖水平，为探讨鱼类的免疫记忆提供了一定的科学理论依据，并丰富和发展了鱼类免疫学的研究内容。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
1 文献综述  13-21
  1.1 鱼类体液免疫概述  13
  1.2 鱼类免疫器官  13-15
    1.2.1 胸腺  13
    1.2.2 肾脏  13-14
    1.2.3 脾脏  14
    1.2.4 黏膜相关淋巴组织  14-15
  1.3 鱼类免疫细胞  15-16
    1.3.1 B 淋巴细胞特性  15
    1.3.2 浆细胞类群  15-16
  1.4 鱼类抗体的研究  16
  1.5 鱼类体液免疫记忆  16-17
  1.6 鱼类免疫研究方法及进展  17-20
    1.6.1 ELISA 检测抗体效价  17-18
    1.6.2 淋巴细胞的分离技术  18
    1.6.3 ELISPOT 检测免疫细胞  18-20
  1.7 研究目的及意义  20-21
2 罗非鱼淋巴细胞分离  21-27
  2.1 引言  21
  2.2 实验材料  21-22
    2.2.1 主要仪器设备  21
    2.2.2 主要试剂  21
    2.2.3 主要溶液配制  21-22
    2.2.4 实验鱼  22
  2.3 实验方法  22-23
    2.3.1 尾静脉采血  22
    2.3.2 淋巴细胞分离  22
    2.3.3 细胞计数  22-23
    2.3.4 数据整理  23
  2.4 结果与分析  23-25
    2.4.1 罗非鱼外周血淋巴细胞分离结果  23-24
    2.4.2 分离细胞的形态观察  24-25
  2.5 讨论  25-27
    2.5.1 稀释倍数对外周血淋巴细胞分离的影响  25-26
    2.5.2 离心力对外周血淋巴细胞分离的影响  26-27
3 ELISPOT 试验最优条件的确定  27-34
  3.1 实验材料  27-28
    3.1.1 仪器设备  27
    3.1.2 主要试剂  27
    3.1.3 溶液配制  27-28
    3.1.4 实验鱼  28
    3.1.5 免疫  28
  3.2 实验方法  28-30
    3.2.1 鼠抗罗非鱼 IgM 与 HRP-羊抗鼠 IgG 最佳结合比例  28-29
    3.2.2 外周血淋巴细胞的分离  29
    3.2.3 细胞计数  29
    3.2.4 IgG 包被浓度的确定  29
    3.2.5 细胞孵育时间的确定  29-30
    3.2.6 数据整理  30
  3.3 结果与分析  30-32
    3.3.1 鼠抗罗非鱼 IgM 与羊抗鼠 HRP-IgG 最佳工作浓度  30
    3.3.2 包被抗原浓度的确定  30-31
    3.3.3 细胞孵育时间的确定  31-32
  3.4 讨论  32-34
4 首次和二次免疫后罗非鱼特异性 ASC 及血清抗体水平检测  34-41
  4.1 实验材料  34
    4.1.1 仪器设备  34
    4.1.2 主要试剂  34
    4.1.3 溶液配制  34
    4.1.4 实验鱼  34
    4.1.5 免疫  34
  4.2 实验方法  34-35
    4.2.1 淋巴细胞悬液制备  34
    4.2.2 细胞计数  34-35
    4.2.3 特异性 ASC 检测  35
    4.2.4 血清抗体水平检测  35
    4.2.5 数据整理  35
  4.3 结果与分析  35-38
    4.3.1 首次免疫后三种组织中特异性 ASCs 的检测  35-36
    4.3.2 二次免疫后三种组织中特异性 ASCs 的检测  36-37
    4.3.3 首次免疫及二次免疫后血清中特异性抗体水平检测  37-38
  4.4 讨论  38-41
5 MTT 法检测罗非鱼淋巴细胞体外增殖  41-46
  5.1 引言  41
  5.2 实验材料  41-42
    5.2.1 仪器设备  41-42
    5.2.2 主要试剂  42
    5.2.3 溶液配制  42
    5.2.4 实验鱼  42
    5.2.5 免疫  42
  5.3 实验方法  42-43
    5.3.1 淋巴细胞悬液制备  42
    5.3.2 细胞计数  42
    5.3.3 正交试验设计  42
    5.3.4 MTT 法筛选最佳培养条件  42-43
    5.3.5 最佳培养条件下检测淋巴细胞增殖  43
    5.3.6 数据整理  43
  5.4 结果与分析  43-44
    5.4.1 正交试验结果  43-44
    5.4.2 最佳条件下三种组织淋巴细胞增殖结果  44
  5.5 讨论  44-46
6 ELISPOT 检测 B 淋巴细胞体外增殖  46-54
  6.1 引言  46
  6.2 实验材料  46-47
    6.2.1 仪器设备  46
    6.2.2 主要试剂  46
    6.2.3 溶液配制  46
    6.2.4 实验鱼  46-47
    6.2.5 免疫  47
  6.3 实验方法  47
    6.3.1 淋巴细胞悬液制备  47
    6.3.2 细胞计数  47
    6.3.3 细胞体外培养及加入抗原刺激  47
    6.3.4 淋巴细胞中特异性 ASC 检测  47
    6.3.5 细胞培养液中抗体水平检测  47
    6.3.6 数据整理  47
  6.4 结果与分析  47-51
    6.4.1 特异性 ASC 体外存活检测结果  47-49
    6.4.2 加入抗原-人 IgG 孵育培养结果  49-50
    6.4.3 加入 LPS 刺激培养结果  50-51
  6.5 讨论  51-54
    6.5.1 头肾、脾脏和外周血中浆细胞的种类  51-52
    6.5.2 外源性抗原对三种组织中 B 淋巴细胞的增殖作用  52-53
    6.5.3 抗原 LPS 对三种组织中 B 淋巴细胞的增殖作用  53-54
结论  54-55
参考文献  55-66
致谢  66-67
作者简历  67-68
导师简介  68

罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究

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