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猪PRRSV HH08株单克隆抗体制备及抗原捕捉ELISA方法建立

作　者: 马玲
导　师: 李广兴
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: PRRSV 单克隆抗体 抗原捕捉ELISA 检测
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。该病通过多种途径传播，建立一种快速高效的ELISA检测方法，对PRRSV检测、免疫学研究具有重要意义和应用价值。将浓缩纯化的PRRSV HH08株免疫BALB/c小鼠，每隔2周免疫一次，待血清抗体效价达到1:10000以上，加强免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。经间接ELISA筛选，有限稀释法克隆，获得了5株稳定分泌抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为A7、B4、B8、B12和G12，并对A7、B4、B8和B12四株杂交瘤株制备了腹水。辛酸-饱和硫酸铵法纯化A7和B8腹水，SDS-PAGE分析可见单一且清晰的分子量约55kDa重链和25kDa轻链，纯化效果好。ELISA检测显示，细胞上清和腹水抗体效价分别在1:256~1:2048和1:6400~1:51200，腹水抗体效价明显高于细胞上清。Western blot结果显示所有单克隆抗体均与PRRSV在蛋白分子量97.2~66.4kDa间出现特异性反应条带，IFA鉴定表明单抗能够识别到病毒而出现特异性荧光。Ig亚类鉴定A7、B8和B12属于IgG2b，B4和G12属于IgM。杂交瘤细胞染色体计数平均数量在84~100条，均多于SP2/0细胞的66条染色体。特异性试验证明这5株单抗仅与PRRSV发生特异性反应。以PRRSV免疫兔制备兔抗PRRSV多克隆抗体，并用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化IgG。以纯化的多克隆抗体作为包被抗体，单克隆抗体B8作为检测抗体，建立抗原捕捉ELISA方法。该方法的最佳反应条件为：兔抗PRRSV多抗包被浓度为40μg/mL，鼠抗PRRSV单抗B8工作浓度为1.25μg/mL，待检样品孵育时间90min，酶标二抗工作浓度为1:5000，实验确定OD490nm＞0.175为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数均小于10%，最低检出量为1735TCID50，可用于检测PRRSV经典株和变异株，与Mrac-145细胞及其他参考猪病病原无交叉反应。采用建立的抗原捕捉ELISA方法检测11份临床感染病料样品，与RT-PCR比较，两者具有很高的符合率。结果表明，建立的抗原捕捉ELISA方法具有较好的特异性和敏感性，可用于PRRSV的快速检测。

全文目录


摘要  16-18
Abstract  18-21
1 前言  21-50
  1.1 PRRSV 病原学  21-32
    1.1.1 PRRSV 基因组结构  23-24
    1.1.2 PRRSV 非结构蛋白  24-26
    1.1.3 PRRSV 结构蛋白  26-32
  1.2 PRRS 流行病学  32-33
  1.3 PRRS 致病机理  33-34
  1.4 PRRS 临床症状和病理变化  34-37
    1.4.1 临床症状  34-35
    1.4.2 病理变化  35-37
  1.5 PRRS 诊断技术  37-43
    1.5.1 临床诊断  37-38
    1.5.2 组织病理学检查  38
    1.5.3 病毒分离  38-39
    1.5.4 分子生物学诊断方法  39-41
    1.5.5 血清学诊断方法  41-43
  1.6 PRRSV 单克隆抗体研究进展  43-48
    1.6.1 单克隆抗体概述  43-44
    1.6.2 抗 PRRSV 单克隆抗体研究进展  44-48
  1.7 研究目的和意义  48-50
2 材料与方法  50-81
  2.1 实验材料  50-57
    2.1.1 实验动物及细胞  50
    2.1.2 病毒  50-51
    2.1.3 培养基和主要试剂  51
    2.1.4 主要试剂配制  51-57
    2.1.5 仪器设备  57
  2.2 实验方法  57-81
    2.2.1 抗原制备  57-58
    2.2.2 BALB/c 小鼠免疫程序  58-59
    2.2.3 间接 ELISA 方法建立  59-60
    2.2.4 杂交瘤细胞株建立与筛选  60-64
    2.2.5 单克隆抗体制备  64-67
    2.2.6 单克隆抗体生物学特性鉴定  67-72
    2.2.7 兔抗 PRRSV 多克隆抗体制备与纯化  72-73
    2.2.8 抗原捕捉 ELISA（AC-ELISA）优化  73-77
    2.2.9 抗原捕捉 ELISA 方法灵敏性试验  77-78
    2.2.10 抗原捕捉 ELISA 方法特异性试验  78
    2.2.11 抗原捕捉 ELISA 方法重复性试验  78-79
    2.2.12 抗原捕捉 ELISA 方法与 RT-PCR 方法检测临床样品  79
    2.2.13 数据统计  79-81
3 结果  81-99
  3.1 抗原制备  81
    3.1.1 病毒增殖及 TCID50测定  81
    3.1.2 病毒浓缩纯化  81
  3.2 单克隆抗体制备  81-83
    3.2.1 间接 ELISA 方法建立  81
    3.2.2 杂交瘤细胞株建立与筛选  81-82
    3.2.3 腹水制备与纯化  82-83
  3.3 单克隆抗体生物学特性鉴定  83-90
    3.3.1 单克隆抗体效价与浓度测定  83-84
    3.3.2 单克隆抗体 Western blot 鉴定  84
    3.3.3 单克隆抗体杂交瘤细胞稳定性  84-86
    3.3.4 杂交瘤细胞染色体计数  86
    3.3.5 单克隆抗体 Ig 亚类鉴定  86-88
    3.3.6 单克隆抗体特异性分析  88
    3.3.7 免疫荧光试验  88-90
  3.4 PRRSV 抗原捕捉 ELISA（AC-ELISA）方法建立与应用  90-99
    3.4.1 兔抗 PRRSV 多克隆抗体制备与纯化  90
    3.4.2 抗原捕捉 ELISA 优化  90-95
    3.4.3 抗原捕捉 ELISA 方法灵敏性试验  95-96
    3.4.4 抗原捕捉 ELISA 方法特异性试验  96-97
    3.4.5 抗原捕捉 ELISA 方法重复性试验  97-98
    3.4.6 抗原捕捉 ELISA 方法与 RT-PCR 方法检测临床样品  98-99
4 讨论  99-109
  4.1 病毒浓缩纯化  99-100
  4.2 杂交瘤细胞株建立及筛选  100-102
  4.3 腹水制备及纯化  102-104
  4.4 单克隆抗体生物学特性鉴定  104-105
  4.5 抗原捕捉 ELISA 检测方法建立  105-109
5 结论  109-110
致谢  110-112
参考文献  112-128
攻读硕士学位期间发表的学术论文  128

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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