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猪肺炎支原体P97 C末端蛋白抗原表位分析及抗原捕捉ELISA方法初步研究

作　者: 张美晶
导　师: 辛九庆
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪肺炎支原体抗原表位肽探针扫描技术抗原捕捉ELISA 菌落形成单位
分类号: S852.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本试验设计了10段覆盖P97 C末端蛋白全长的连续或重叠短肽序列,并将其进行了原核表达。将表达后的融合蛋白分别与针对猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)P97 C末端蛋白的两株单克隆抗体(A3C9和B4D5)进行Western blotting反应,初步筛选P97 C末端蛋白的抗原表位。为了详细研究P97 C末端蛋白的表位结构,进一步采用了肽探针扫描技术对表位进行精确定位,精确鉴定出两个最小抗原决定区域:F905PMAFSY911 (905～911 aa)和G991TPNQGKKAE1000(991～1 000 aa)。同源性分析表明,两个表位序列在Mhp各毒株中具有较高的保守性,是Mhp保守的种属特异性表位。生长抑制试验结果显示,A3C9和B4D5两株单抗对Mhp的生长有较好的抑制效果(尤其单抗B4D5)。免疫原性与反应原性分析显示:两个表位多肽具有较好的免疫原性和反应原性,可作为多表位疫苗和诊断试剂研究的候选短肽。另外,本研究还以单抗A3C9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的单抗AF11为检测抗体(两株单抗识别Mhp不同抗原决定簇),初步建立了抗原捕捉ELISA方法。通过对反应条件的优化,最后确定单抗A3C9以1:800稀释,抗原以1:16倍稀释,检测抗体以1:400倍稀释时反应条件最佳;同时抗原与检测抗体的最佳孵育时间为60 min;包被液最终确定为pH9.6的碳酸盐缓冲液;封闭液为5%鱼明胶。特异性试验表明,该方法能特异性识别猪肺炎支原体(Mhp)J株,与丝状支原体丝状亚种LC型Y-goat标准株、无乳支原体PG2株、丝状支原体丝状亚种SC型PG1标准株、猪絮状支原体27399株、山羊肺炎亚种87001株和猪鼻支原体BST-7株均无交叉反应。本试验重复性较好,板内板间变异系数均小于10%。敏感性试验表明,该方法检测Mhp活菌的灵敏度能到达6.4×104 CFU /mL(CFU为菌落形成单位)。本方法与分离培养法及PCR方法比较结果显示:阳性符合率分别为50%和75%;统计学分析显示本方法与病原分离方法差异不显著(χ2值为3,P>0.05)。本研究为进一步阐明Mhp P97蛋白抗原结构与功能关系,设计科学合理的基因工程疫苗提供了重要的参考依据。同时,抗原捕捉ELISA方法的初步研究也为Mhp感染的快速确诊提供了新的检测方法,对猪肺炎支原体现地临床检测具有重要参考价值。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章引言  14-26
  1.1 猪肺炎支原体的研究概况  14-16
    1.1.1 病原学  14-15
    1.1.2 流行病学  15
    1.1.3 发病机制  15
    1.1.4 临床症状及病理变化  15-16
    1.1.5 猪支原体肺炎免疫学研究  16
  1.2 猪肺炎支原体的基因组结构及主要蛋白  16-19
    1.2.1 猪肺炎支原体的基因组结构  16
    1.2.2 P97 黏附因子  16-17
    1.2.3 P102 蛋白  17
    1.2.4 P46 蛋白  17-18
    1.2.5 P159 蛋白  18
    1.2.6 P65 蛋白  18
    1.2.7 Dnak 蛋白  18
    1.2.8 P36 蛋白  18-19
  1.3 抗原表位及猪肺炎支原体抗原表位研究概况  19-21
    1.3.1 抗原表位研究方法  19-20
    1.3.2 抗原表位研究的意义  20
    1.3.3 抗原表位应用前景  20
    1.3.4 猪肺炎支原体抗原表位的研究进展  20-21
  1.4 Mhp 诊断方法的研究进展  21-23
    1.4.1 病原学诊断方法  21
    1.4.2 血清学诊断方法  21-22
    1.4.3 分子生物学诊断方法  22-23
  1.5 猪肺炎支原体的防治  23-25
    1.5.1 国外疫苗研究进展  23
    1.5.2 国内疫苗研究进展  23-24
    1.5.3 基因工程疫苗  24-25
  1.6 本研究的目的和意义  25-26
第二章猪肺炎支原体 P97 C 末端蛋白表位分析  26-42
  2.1 材料和方法  26-33
    2.1.1 材料  26-29
    2.1.2 实验方法  29-33
  2.2 结果  33-39
    2.2.1 Mhp P97 C 末端蛋白表位预测及短肽设计  33-34
    2.2.2 Mhp P97 C 末端蛋白表达  34-35
    2.2.3 抗原表位的初步筛选  35
    2.2.4 ELISA 初步筛选抗原表位  35-36
    2.2.5 Pepscan 技术确定最小抗原决定簇  36
    2.2.6 表位多肽免疫原性检测  36-37
    2.2.7 表位多肽反应原性检测  37-38
    2.2.8 表位序列保守性及同源性分析  38-39
    2.2.9 生长抑制实验  39
  2.3 讨论  39-42
第三章抗原捕捉 ELISA 方法的初步研究  42-62
  3.1 材料  42-43
    3.1.1 主要试剂  42
    3.1.2 样本和菌株  42-43
    3.1.3 实验设备  43
  3.2 方法  43-47
    3.2.1 单抗腹水的纯化  43
    3.2.2 单抗浓度的测定  43-44
    3.2.3 12% SDS-PAGE 凝胶电泳检测单抗纯度  44
    3.2.4 简易过碘酸钠法 HRP 标记单抗  44
    3.2.5 单抗标记效果的测定  44
    3.2.6 抗原的制备  44
    3.2.7 AC-ELISA 方法的建立及条件优化  44-46
    3.2.8 AC-ELISA 方法的评估  46-47
  3.3 实验结果  47-59
    3.3.1 纯化后单抗的纯度及浓度确定  47-48
    3.3.2 单抗标记效果的测定  48
    3.3.3 AC-ELISA 方法的建立及条件优化  48-56
    3.3.4 AC-ELISA 方法的评估  56-59
  3.4 讨论  59-62
    3.4.1 配对抗体的选择  59
    3.4.2 单抗的纯化及酶标记  59-60
    3.4.3 ELISA 的特异性及敏感性  60
    3.4.4 AC-ELISA 的反应时间  60
    3.4.5 AC-ELISA 的判定标准  60
    3.4.6 ELISA 的临床应用  60-61
    3.4.7 保存期试验  61-62
第四章全文结论  62-63
参考文献  63-69
致谢  69-70
作者简历  70
攻读硕士学位期间发表的学术论文  70

猪肺炎支原体P97 C末端蛋白抗原表位分析及抗原捕捉ELISA方法初步研究

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