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猪流行性腹泻病毒受体pAPN功能域的初步鉴定

作　者: 单智夫
导　师: 李一经
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒 受体功能域的确定 非容许性细胞 病毒增殖
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)可导致仔猪的严重腹泻,尤其在东亚各国传播非常广泛,每年都造成严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属,是Ⅰ群冠状病毒的成员。目前对于PEDV感染机理方面的研究较少,2007年猪氨基肽酶(porcine aminopeptidase N, pAPN)被证实为PEDV的功能性细胞感染受体,继而又有研究从数量上证实增加pAPN的密度增大可以PEDV感染率。2010年新的研究通过尝试多种不同方式将pAPN添加到Vero细胞后再感染PEDV,进一步可证明pAPN对PEDV的入侵和增殖的促进作用。至今,还未见其它有关PEDV感染机理以及pAPN在PEDV感染过程中作用的研究报道。为进一步确定pAPN与PEDV结合的区域,首先将除去信号肽的pAPN分为SPA, SPB和SPC三段,接着利用一对同尾酶Xholl和SaiⅠ将信号肽分别与SPA,SPB和SPC相连接后再构建到杆状病毒表达载体pFastBacTM1上,通过杆状病毒-昆虫细胞表达体系进行表达。分得到的三段蛋白经SDS-PAGE与Western-blot鉴定大小分别为SPA约42kD,SPB和SPC均约56kD,与预期值相符。再利用得到的蛋白免疫小鼠制备相应的抗血清,各段抗血清均可与天然pAPN反应,证明了所制蛋白具有一定特异性。为了使pAPN分段蛋白在真核细胞上进行表达,将与信号肽相连的SPA,SPB和SPC片段构建到哺乳动物真核细胞表达载体pcDNA3.1上,分别将三个片段转染到PEDV非容许性细胞MDCK上,应用免疫荧光检验其在MDCK细胞上的表达情况,结果表明SPA,SPB和SPC片段与天然pAPN的多抗血清反应均出现了明亮的绿色荧光,证明了三个片段转染到MDCK后均得到表达。分别将表达三个片段的MDCK细胞接种PEDV48h后观察到细胞的病变情况,结果在SPC段的MDCK上接种PEDV48h后出现了明显的细胞脱落,变形等病变。同样,应用免疫荧光技术也可以在转染SPC片段的MDCK细胞上检测出明亮而清晰的绿色荧光,进一步说明了表达的SPC可以与PEDV相结合。将PEDV在表达SPC的MDCK上连续传代五代后通过PCR的方法仍可以检测到PEDV的存在,这也证明了在MDCK上表达SPC段蛋白可使PEDV在非容许的细胞上进行增殖。最后在表达SPC的MDCK上添加相应片段抗血清,病变可被抑制发生。以上结果均说明SPC段在PEDV入侵细胞及增殖过程中发挥着重要的作用,即受体功能域的所在是pAPN第500a.a.-963a.a.。从而达到对受体功能域的初步筛选,并为研究PEDV在非容许性细胞MDCK上的增殖奠定了基础。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1. 引言  12-20
  1.1 猪流行性腹泻流行特点及流行现状  12-13
  1.2 PEDV的病毒学分类及其主要结构基因  13-16
    1.2.1 S(spike)基因与S蛋白的功能特性  14-15
    1.2.2 E(small membrane)基因功能特点  15
    1.2.3 M(membrane)基因与M蛋白的功能特性  15
    1.2.4 N(nucleocpsid)基因与N蛋白的功能特性  15
    1.2.5 开放阅读框架ORF3  15-16
  1.3 PEDV感染特性的研究进展  16-17
  1.4 Ⅰ群冠状病毒受体研究进展  17-19
  1.5 研究的目的及意义  19-20
2. 材料与方法  20-38
  2.1 实验材料  20-24
    2.1.1 细胞与毒株  20
    2.1.2 菌种与质粒  20
    2.1.3 引物设计与合成  20-21
    2.1.4 主要试剂  21-22
    2.1.5 实验动物及抗体  22
    2.1.6 实验主要仪器设备  22-24
  2.2 试验方法  24-38
    2.2.1 各分段的pAPN在昆虫细胞-杆状病毒体系中的表达  24-33
    2.2.2 鼠抗SPA、SPB和SPC血清及天然pAPN血清的制备  33
    2.2.3 各分段的pAPN与PEDV作用结果研究  33-38
3. 结果  38-49
  3.1 各分段pAPN在昆虫细胞-杆状病毒体系中的表达  38-43
    3.1.1 目的基因的PCR扩增结果  38
    3.1.2 重组质粒pFastBac~(TM)1-SPA,pFastBac~(TM)1-SPB及pFastBac~(TM)1-SPC的鉴定结果  38-40
    3.1.3 重组杆粒rAcBacmid-SPA,rAcBacmid-SPB和rAcBacmid-SPC感染昆虫细胞的鉴定结果  40-41
    3.1.4 表达蛋白产物的SDS-PAGE分析  41-42
    3.1.5 表达蛋白的Western blotting检测  42
    3.1.6 多克隆抗体效价的测定  42-43
  3.2 pAPN与PEDV结合区域的鉴定  43-49
    3.2.1 重组质粒pcDNA3.1-SPA,pcDNA3.1-SPB和pcDNA3.1-SPC的鉴定  43-44
    3.2.2 免疫荧光鉴定重组质粒pcDNA3.1-SPA,pcDNA3.1-SPB和pcDNA3.1-SPC的表达  44-45
    3.2.3 病毒感染表达不同片段的细胞的病变  45
    3.2.4 病毒感染表达不同片段的MDCK的免疫荧光结果  45-46
    3.2.5 提取病毒RNA验证  46-47
    3.2.6 SPC抗血清抑制病变的发生  47-49
4 讨论  49-53
  4.1 选择昆虫细胞表达各分段pAPN并制备抗血清的优点  49
  4.2 MDCK细胞表达分段pAPN对PEDV易感性分析  49-50
  4.3 SPC段与PEDV的特异性结合  50-51
  4.4 获得非容许性细胞MDCK与PEDV增殖  51-52
  4.5 本研究结果的理论及实践意义  52-53
5 结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-62
攻读硕士学位期间发表的论文  62

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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