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核糖体展示Anticalin模拟抗体库筛选抗氨苄青霉素模拟抗体

作　者: 李晓芳
导　师: 高志贤
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 胆汁三烯结合蛋白 核糖体展示 氨苄青霉素 文库构建 筛选
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


氨苄青霉素是重要的β-内酰胺类抗生素之一,常用于治疗奶牛和其他食用动物疾病。残留在动物性食品中的氨苄青霉素会对人体、环境或工业生产造成巨大的危害。WHO报告中指出氮苄青霉素的副作用发生率在各种药品中占第二位。免疫学分析方法检测氨苄青霉素具有快速简便的特点,但氨苄青霉素特异性抗体由于完全抗原制备困难、免疫时间长等缺点不易获得。Anticalin是以天然小分子受体蛋白Lipocalin为骨架,采用随机突变技术制备的小分子特异性识别体,因具有类似抗体的特点,也可以称之为模拟抗体。Anticalin具有基因工程抗体分子量较小的优点,同时具有其独特的优势:Lipocalin本身是运输小分子的蛋白,更适合与小分子物质结合;袋状识别位点具有很大的分子接触表面;通过基因工程方法更容易对其进行改造;所制备的Anticalin具有较高的亲和力与稳定性。本实验利用核糖体展示抗体库库容量大、建库和筛选方法简便的优势构建Anticalin模拟抗体库。首先进行胆汁三烯结合蛋白（BBP）的基因优化与高效表达:以天然的BBP基因为模板,根据大肠杆菌偏好密码子优化设计并合成BBP的12条寡核苷酸引物,经重叠PCR合成BBP基因,扩增优化后的BBP序列。经测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a与pBV-220上构建表达质粒pET-32a-BBP与pBV-220-BBP,进行诱导表达后重组蛋白约占细胞总蛋白的40%和65%。重组蛋白以包涵体的形式存在,通过盐酸胍变性及尿素复性后,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,获得纯度达98%以上的融合蛋白。Western印迹证明获得了纯度较高的BBP。以获得的BBP基因为模板,设计包含16个随机突变位点的引物合成Acticaiin模拟抗体库。同时引入核糖体展示所必需的全部组件,采用重叠PCR技术将Acticalin库与核糖体展示组件进行拼接,大小约为930bp,从而构建了核糖体展示Acticalin模拟抗体库。对该文库进行体外转录和体外翻译鉴定,以证明其可以有效地进行体外转录翻译。将构建的Anticalin文库进行体外转录和体外翻译后,产生了模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体文库。以小分子抗原氨苄青霉素为靶标,利用固相亲和方法筛选抗氨苄青霉素抗体。通过改变Mg2+浓度将筛选得到的模拟抗体-核糖体-mRNA三联体解离,得到模拟抗体对应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库并重新引入核糖体展示元件进行下一轮淘筛。通过多轮生物淘筛,抗原阳性的模拟抗体得到富集,最终获得高特民性抗氨苄青霉素抗体。将该抗体序列在大肠杆菌中进行高效表达得到特异蛋白条带,经WB印迹验证该蛋白为抗氨苄青霉素抗体。因为所用模拟抗体库本身具有的通用性,理论上可以以任意抗原为靶标筛选其亲和抗体,这就为利用核糖体展示技术从模拟抗体库中筛选多种抗原特别是小分子半抗原的特异性模拟抗体奠定了基础。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
缩略词表  13-14
第一章 前言  14-25
  1.Anticalin概况  14-15
  2 核糖体展示技术的原理  15-16
  3 RD Anticalin模拟抗体库制备技术的基本原理及过程  16
  4.RD Anticalin模拟抗体库的优点  16-18
    4.1 Anticalin突变库的优点  16-17
    4.2 核糖体展示的优点  17-18
  5 国内外研究现状  18-19
    5.1 Anticalin制备技术的研究进展  18
    5.2 RD技术适合从突变库中筛选特异模拟抗体  18-19
  6.氨苄青霉素的污染现状、危害及快速检测的现状  19-22
    6.1 氨苄青霉素性质  19-20
    6.2 氨苄青霉素的应用  20
    6.3.Amp残留的影响及危害  20-21
    6.4.残留分析方法  21-22
      6.4.1 微生物检测法  21
      6.4.2 高效液相色谱法(HPLC)  21
      6.4.3 色/质联用测定法  21-22
      6.4.4 气相色谱法(GC)  22
      6.4.5 薄层色谱法(TLC)  22
      6.4.6 免疫分析法  22
  7.研究的目的和意义  22-24
  8.技术路线图  24-25
第二章 BBP的合成与高效表达  25-43
  1.前言  25
  2.材料与方法  25-35
    2.1 材料  25-26
      2.1.1 质粒与菌株  25
      2.1.2 主要试剂  25-26
      2.1.3 主要仪器设备  26
    2.2 方法  26-35
      2.2.1 BBP序列的优化设计与引物合成  26-27
      2.2.2 BBP基因的PCR合成  27-30
        2.2.2.1 BBP基因的分段物合成  28-29
        2.2.2.2 BBP基因的1-8引物合成  29
        2.2.2.3 BBP基因全长的合成  29-30
      2.2.3 DH5α感受态细胞  30
      2.2.4 BBP克隆重组载体的构建与鉴定  30-31
      2.2.5 重组表达质粒pET-32a-BBP的构建与诱导表达  31-32
        2.2.5.1 pET-32-BBP表达质粒的构建  31
        2.2.5.2 pET-32a-BBP的诱导表达  31-32
      2.2.6 重组表达质粒pBV-220-BBP的构建与诱导表达  32-33
        2.2.6.1 表达质粒pBV-220-BBP的构建  32-33
        2.2.6.2 pBV-220-BBP的诱导表达  33
      2.2.7 BBP的变复性  33-34
      2.2.8 BBP的纯化  34
        2.2.8.1 Ni柱再生:  34
        2.2.8.2 Ni柱纯化  34
      2.2.9 BBP的Western blot检测  34-35
  3.结果与分析  35-40
    3.1 合成序列的PCR结果  35
    3.2 克隆载体pEasy-BBP的鉴定  35-36
    3.3 BBP合成序列的测序结果  36-37
    3.4 表达载体pET-32a-BBP的鉴定  37-38
      3.4.1 pET-32a-BBP的酶切鉴定  37
      3.4.2 pET-32a-BBP的诱导表达  37-38
    3.5 表达载体pBV-220-BBP的鉴定  38-39
      3.5.1 pBV-220-BBP的酶切鉴定  38-39
      3.5.2 pBV-220-BBP的诱导表达  39
    3.6 纯化结果的SDS-PAGE分析  39-40
    3.7 纯化BBP的Western印迹分析  40
  4.讨论  40-43
第三章 Acticalin库的构建与质量鉴定  43-63
  1.前言  43
  2.材料与方法  43-56
    2.1 材料  43-44
      2.1.1 质粒与菌株  43-44
      2.1.2 主要试剂  44
      2.1.3 主要仪器  44
    2.2 方法  44-56
      2.2.1 Acticalin模拟抗体库构建的引物合成  44-45
      2.2.2 Acticalin模拟抗体库的构建  45-47
      2.2.3 核糖体展示Acticalin模拟抗体库的构建  47-52
        2.2.3.1 TAC启动子、SD序列及BBP前237bp片段的扩增  47-49
        2.2.3.2 BBP的219-402bp的扩增  49-50
        2.2.3.3 G4S、Protein D与BBP的384-522bp扩增  50-52
        2.2.3.4 以TAC为启动子的库全长合成  52
      2.2.4 以T7为启动子的核糖体库的构建  52-54
        2.2.4.1 T7启动子的扩增  52-53
        2.2.4.2 除启动子外全长的合成  53
        2.2.4.3 T7库全长的合成  53-54
      2.2.5 Acticalin文库的完整性与多样性鉴定  54
      2.2.6 Acticalin库容量的鉴定  54
      2.2.7 RD Acticalin模拟抗体库的可扩增性鉴定  54-55
        2.2.7.1 Tac启动子抗体库的可扩增性鉴定  54-55
        2.2.7.2 T7启动子抗体库的可扩增性鉴定  55
      2.2.8 ScFv文库的转录活性与反转录活性鉴定  55-56
        2.2.8.1 转录活性鉴定  55-56
        2.2.8.2 反转录活性鉴定  56
  3.结果与分析  56-60
    3.1 Aeticalin模拟抗体库的分段合成  56-57
    2.2 库的合成  57
    2.3 T7库与Tac库的阳性鉴定  57-58
    3.4 库的测序鉴定  58-59
    3.5 ScFv抗体库容量  59-60
    3.6 转录活性鉴定  60
    3.7 反转录活性鉴定  60
  4.讨论  60-63
第四章 氨苄青霉素全抗原的合成与模拟抗体的筛选  63-76
  1.前言  63
  2 材料与方法  63-70
    2.1 材料  63-64
      2.1.1 质粒与菌株  63-64
      2.1.2 主要试剂  64
      2.1.3 主要仪器  64
    2.2 方法  64-70
      2.2.1 包被原(Amp-PLL)的合成  64-65
      2.2.2 包被原蛋白定量鉴定  65
      2.2.3 ScFv文库的体外转录与翻译  65-66
      2.2.4 ScFv文库的体外筛选  66
      2.2.5 mRNA的纯化  66-67
        2.2.5.1 纯化前准备工作  66
        2.2.5.2 纯化步骤  66-67
      2.2.6 DNA模板的去除  67
      2.2.7 mRNA反转录  67
      2.2.8 RT-PCR重新构建RD模板  67-69
        2.2.8.1 Acticalin库的扩增  67-68
        2.2.8.2 ProteinD与3'—Loop连接Acticalin库  68
        2.2.8.3 T7启动子连接Acticalin库  68-69
      2.2.9 筛选抗体库的鉴定  69
      2.2.10 抗体片段的表达  69
      2.2.11 ELISA法测定单链抗体与抗原结合特异性  69-70
  3.结果与分析  70-73
    3.1 包被原蛋白浓度的测定  70-71
    3.2 RT-PCR重新构建RD模板  71
    3.3 测序结果  71-72
    3.4 表达产物鉴定  72-73
    3.5 单链抗体与抗原结合特异性  73
  4.讨论  73-76
结论  76-77
参考文献  77-82
致谢  82-83
附录  83-84

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医毒物学 > 动物性食品中化学物残留
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