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日本脑炎病原检测与免疫防治方法的研究

作　者: 康乐
导　师: 陈溥言
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本脑炎病毒(JEV) SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR 灭活疫苗佐剂体液免疫细胞免疫
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

日本脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的中枢神经系统的急性传染病。本病在世界许多国家广泛存在,不但对养猪业造成了巨大的经济损失,而且严重威胁着人类的健康。JE的诊断可以通过临床检测结合流行病学进行,确诊需要实验室血清学检测和病原学检测。目前,乙脑的治疗没有有效的方法,只有进行疫苗接种结合灭蚊工作进行。本实验从乙脑的检测和防治方面做了以下研究。一、日本脑炎病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用本实验分别以JEV保守的prM,NS1及E基因片段为模板设计三对引物,筛选基于SYBR Green Ⅰ模式的实时荧光PCR的最佳引物,以建立快速、准确检测日本脑炎病毒的实时荧光PCR方法。以测序正确的阳性质粒为标准品建立标准曲线,并方法的敏感性、特异性、可重复性进行评价。结果表明,以E蛋白核苷酸序列957-1431bp区域作为模板设计的引物,灵敏度较其他两个高,该方法只从JEV阳性样本检出扩增信号,不与其它病原出现交叉反应；熔解温度为86.2±0.5℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体；在1×103～1×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率94.2%,最低可检测1000拷贝以下反应阳性标准品,比常规PCR敏感至少103倍；组内变异系数、组间变异系数分别为0.53%～1.42%、1.16%。对16例猪乙脑临床疑似病料进行检测,阳性率为81.25%(13/16),阳性样品扩增片段大小为475bp,与预期大小相当。本研究建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR特异性强、灵敏度高、检测迅速,为JEV的快速检测、分子流行病学调查提供新方法。二、一株猪源日本脑炎灭活疫苗配伍不同的佐剂在小鼠体内的免疫特性研究为了评价发展一种有效的由VerO细胞增殖的猪源日本脑炎疫苗,本研究以一株从蚊体中分离得到的猪源日本脑炎病毒NJ2008株作为灭活疫苗研究用种毒,经BHK细胞增殖后病毒效价可达108.67TCID50/mL。将病毒接种于长满Vero细胞的转瓶上培养,收集病毒液,经纯化、浓缩后以0.2%的福尔马林灭活,病毒经福尔马林灭活后分别与Montanide ISA15AVG白油佐剂、铝胶佐剂、弗氏不完全佐剂(F1人)和蜂胶佐剂配伍制成灭活疫苗。4-6周龄的BALB/c小鼠(均为雌性),随机分为6组,每组12只,前四组进行不同佐剂的灭活疫苗的免疫,第五、六组分别为弱毒疫苗SA14-14-2和PBS对照组,进行小鼠体内的免疫特性比较,并做攻毒保护实验。结果表明,配伍白油ISA15AVG佐剂的乙脑灭活疫苗表现突出,它不仅刺激产生的抗体应答水平最快、最高,而且可以同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,对致死量乙脑强毒的抗攻击能力与弱毒疫苗相当,为预防治疗乙脑又提供了一个新型选择。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
缩略语表  9-11
第一部分文献综述  11-43
  第一章日本脑炎病毒的病原学  11-23
    1 日本脑炎流行特征及危害  12-14
    2 日本脑炎病毒的分类及分型  14-15
    3 日本脑炎的病原学特性  15-16
    4 日本脑炎病毒致病机制  16-18
    5 日本脑炎病毒基因和蛋白的结构和功能  18-20
    6 日本脑炎病毒的毒力分析  20-21
    7 日本脑炎的防治  21-23
  第二章日本脑炎病毒的诊断学方法  23-35
    1 JEV的检测方法的研究进展  23-24
    2 PCR诊断技术研究进展  24-26
    3 荧光定量PCR  26-30
    4 实时荧光定量PCR技术的分析方法  30-34
    5 展望  34-35
  第三章日本脑炎疫苗研究现状及展望  35-43
    1 传统疫苗  35-40
    2 新型疫苗  40-41
    3 展望  41-43
第二部分课题研究  43-75
  第四章日本脑炎病毒SYBR GREEN Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用  43-57
    摘要  43-44
    1 材料和方法  44-46
      1.1 病毒、细胞、质粒和菌种  44
      1.2 主要仪器与试剂  44-45
      1.3 标准阳性模板的制备  45
      1.4 焚光定量PCR方法的建立  45-46
    2. 结果  46-48
    3 讨论  48-55
    ABSTRACT  55-57
  第五章日本脑炎灭活疫苗配伍不同的佐剂在小鼠体内的免疫特性研究  57-75
    摘要  57-58
    1 材料与方法  58-63
    2 结果  63-66
    3 讨论  66-73
    ABSTRACT  73-75
参考文献  75-85
全文总结  85-87
致谢  87

日本脑炎病原检测与免疫防治方法的研究

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