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产气荚膜梭菌α、ε毒素突变体构建及应用

作　者: 李箐
导　师: 王景林
学　校: 安徽医科大学
专　业: 微生物学
关键词: 产气荚膜梭菌ε毒素产气荚膜梭菌α毒素突变体卵黄抗体候选疫苗
分类号: S852.44
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)根据其产生的主要的四种外毒素α、β、ε、ι可分为A、B、C、D、E五种型。各型产气荚膜梭菌均可产生α毒素(CPA),但其主要由A型产气荚膜梭菌产生,产气荚膜梭菌α毒素具有磷脂酶C、鞘磷脂酶及溶血活性,可引起人畜的气性坏疽和人类的食物中毒等疾病；产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)由B型和D型产气荚膜梭菌产生,具有神经毒性、肠坏死性等致死活性,可导致山羊、绵羊等的致死性肠道疾病,如肠毒血症和坏死性肠炎。鉴于产气荚膜梭菌α毒素和ε毒素的强致死性,所以作为重要的生物毒素战剂及潜在的生物恐怖剂,被列入生物两用品进出口管制清单,因此发展有效应对两种毒素的疫苗或抗体则显得尤为重要。本研究通过构建ETX突变体(mETX)及CPA突变体(mCPA),实现其在原核表达系统中的可溶性表达及纯化,并鉴定其抗原性及生物学活性,筛选出有效的候选抗原,最终制备mETX候选疫苗及mCPA卵黄抗体。首先,通过定点突变的方法构建mETX重组表达质粒(pTIG-mETXH106P, pTIG-mETXS111H,pTIG-mETXS111Y,pTIG-mETXF199H,pTIG-mETXF199E, pTIG-mETXS111YF199E),并转化至E.coli BL21(DE3)细胞中,通过PCR、双酶切及测序鉴定确认序列正确。扩大培养重组表达工程菌,经0.5mM IPTG16℃过夜诱导表达,用螯合有Ni2+的亲和层析柱进行纯化。得到的mETX对其活性及抗原性进行鉴定,用MTS法染色分析,计算mETX对MDCK细胞的半数致死剂量(CT50)并与重组野生型ETX的CT50进行比较,分析其统计学差异。筛选出无毒或低毒性的突变体mETXH106P和mETXF199E与铝佐剂充分混匀后分别免疫Balb/c小鼠,免疫后用间接ELISA方法检测血清抗体效价,最后一次免疫后一周用有活性的重组ETX对健康小鼠进行攻毒试验,并收集血清与有活性的重组ETX在进行体外中和试验,观察保护效果。其次,通过定点突变的方法构建mCPA重组表达质粒(pTIG-mCPAD56S, pTIG-mCPAH68S),并转化至E.coli Origami表达感受态中,经过PCR、双酶切及测序鉴定序列完全正确后,扩大培养重组表达工程菌,经0.5mM IPTG16℃过夜诱导表达,用螯合有Ni2+的亲和层析柱进行纯化。得到的mCPA对其卵磷脂酶C活性、溶血活性及抗原性进行鉴定,经鉴定后两种突变体毒素均丧失其生物学活性同时保留有抗原性。选择健康产蛋母鸡进行免疫,首次免疫7日后,收集鸡蛋,用水稀释法对鸡卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of egg yolk, IgY)进行分离纯化,间接ELISA法检测卵黄抗体效价,冷冻干燥保存。最终,本研究成功构建并表达了突变体蛋白mETX和mCPA,筛选出减毒或无毒性的ε毒素突变体可作为制备预防ε毒素疫苗的候选抗原,并且成功获得高特异性的α毒素IgY卵黄抗体,可用于α毒素检测方法的建立。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-13
第一部分产气荚膜梭菌ε毒素突变体构建及其作为候选疫苗  13-31
  引言  13-14
  1 材料与方法  14-21
  2 结果  21-29
  3 讨论  29-31
第二部分产气荚膜梭菌α毒素突变体构建及卵黄抗体的制备  31-48
  引言  31-32
  1 材料与方法  32-38
  2 结果  38-46
  3 讨论  46-48
结论  48-49
参考文献  49-52
附录  52-53
致谢  53-54
综述  54-59
  参考文献  57-59

产气荚膜梭菌α、ε毒素突变体构建及应用

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