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产气荚膜梭菌ε毒素突变基因重组乳酸杆菌的构建及其免疫学评价

作　者: 王超
导　师: 李一经
学　校: 东北农业大学
专　业: 兽医微生物与免疫学
关键词: 产气荚膜梭菌ε毒素突变基因乳酸杆菌
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是广泛存在自然界的一种常见的条件性致病菌,能够引起动物产生坏死性肠炎、肠毒血症等,同时也是导致人类食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。按毒素型分类,可将其分为A、B、C、D、E五个型,目前,已发现的外毒素至少有13种,其中α、β、ε和ι是主要的外毒素。ε毒素由B型和D型产气荚膜梭菌所产生,是D型产气荚膜梭菌的主要毒素,同时也是一种孔毒素,对MDCK(犬肾细胞)具有致死作用。为研究突变的产气荚膜梭菌ε毒素(mε)的抗体是否具有中和作用,本研究以毒素D型产气荚膜梭菌全基因组DNA为模板,应用重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将ε毒素第106位的组氨酸残基定点突变成脯氨酸残基,扩增出mε基因,使其丧失生物学毒性而保持其免疫原性。以pET-28a作为表达载体,构建了重组表达质粒pET-mε,并转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达重组mε毒素蛋白,SDS-PAGE及western blot分析显示,表达的重组蛋白大小约39ku,主要以包涵体形式存在。将重组蛋白免疫家兔,所制备的产气荚膜梭菌mε毒素蛋白的抗血清经10倍稀释后,与2倍最小致死量(MLD)的产气荚膜梭菌培养上清等体积混合时,能够有效中和ε毒素。这些结果表明,重组突变的ε毒素具有较强的抗原性,这为产气荚膜梭菌候选亚单位疫苗的研究及其血清学诊断方法的建立奠定了基础。根据乳酸杆菌密码子使用的偏爱性,对ε毒素突变基因进行了优化并合成。以pPG-2作为其表达载体,构建了重组表达质粒pPG-2-ms,并电转化至戊糖乳杆菌L. pentosus及干酪乳杆菌L.casei’中,成功构建重组戊糖乳杆菌pPG-2-mε/L. pentosus及重组干酪乳杆菌pPG-2-mε/L. pentosus。将构建的两种重组乳酸杆菌通过1%乳糖诱导进行目的蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示,均有大小约39ku的融合蛋白表达,所表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot鉴定结果表明,这两种重组菌表达的蛋白均可被产气荚膜梭菌ε毒素兔抗血清所识别,证实了ε毒素在两种乳酸杆菌中确实得到了表达。为探讨表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的重组戊糖乳杆菌系统及重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值,本实验以BALB/c小鼠作为实验动物,进行口服免疫实验。实验组Ⅰ口服重组戊糖乳杆菌,实验组Ⅱ口服干酪乳杆菌,实验组Ⅲ口服PBS作为对照。共免疫三次,每隔2w免疫一次,每次连续免疫3d。免疫后分别测定各组小鼠在第4、5、6、8、10、12、18、19、20、22、24、26、32、33、34、36、38、40d时的粪便、鼻腔冲洗液及阴道冲洗液中抗ε毒素的特异性slgA水平以及血清中抗ε毒素的特异性IgG水平。ELISA检测结果表明,经口服免疫重组戊糖乳杆菌及重组干酪乳杆菌的小鼠,在其粪便、鼻腔冲洗液及阴道冲洗液中均检测到了特异性slgA抗体,并在其血清中也检测到了较高水平的特异性IgG抗体。这表明重组戊糖乳杆菌系统及重组干酪乳杆菌能够有效刺激机体产生局部黏膜免疫应答和体液免疫应答。重组乳酸菌免疫小鼠的攻毒试验结果表明,两种重组乳酸杆菌免疫小鼠均能对小鼠产生一定的免疫保护作用,其中重组干酪乳杆菌的效果要好于重组戊糖乳杆菌。本研究首次构建了重组产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的戊糖乳杆菌及干酪乳杆菌分泌表达系统,并产生良好的免疫效果,为产气荚膜梭菌ε毒素口服疫苗的研制以及疾病的诊断防治奠定了坚实的基础。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 引言  12-22
  1.1 产气荚膜梭菌病的流行病学  12-13
  1.2 产气荚膜梭菌的生物学特性及外毒素的研究进展  13-15
    1.2.1 产气荚膜梭菌的生物学特性  13-14
    1.2.2 产气荚膜梭菌的外毒素及其相关疾病  14-15
  1.3 产气荚膜梭菌ε毒素研究进展  15-17
    1.3.1 ε毒素的结构及免疫原性  15-16
    1.3.2 ε毒素的生物学特性与致病机理  16
    1.3.3 ε毒素的临床症状  16-17
    1.3.4 ε毒素疫苗的研究进展  17
  1.4 乳酸杆菌用作活疫苗传递载体的研究进展  17-21
    1.4.1 乳酸杆菌的分子生物学和生化性质  18
    1.4.2 乳杆菌的粘附性和定植能力  18
    1.4.3 乳酸杆菌免疫原性和佐剂性  18-19
    1.4.4 乳酸杆菌作为活疫苗传递载体的特点  19
    1.4.5 乳酸杆菌作为活疫苗传递载体的应用  19-20
    1.4.6 乳酸菌与胃肠道黏膜免疫  20-21
    1.4.7 乳酸菌作为口服疫苗的展望  21
  1.5 研究的目的和意义  21-22
2 材料及方法  22-36
  2.1 实验材料  22-23
    2.1.1 菌种和质粒  22
    2.1.2 实验动物  22
    2.1.3 引物及序列合成  22
    2.1.4 主要试剂  22-23
  2.2 实验方法  23-36
    2.2.1 表达产气荚膜梭菌ε毒素突变基因(mε)重组大肠杆菌的构建  23-28
    2.2.2 重组大肠杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定  28-29
    2.2.3 重组大肠杆菌免疫学指标的测定  29-31
    2.2.4 表达产气荚膜梭菌ε毒素突变基因重组戊糖乳杆菌及干酪乳杆菌的构建  31-33
    2.2.5 重组戊糖乳杆菌与重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定  33-34
    2.2.6 口服重组乳酸杆菌免疫学指标的测定  34-36
3 实验结果  36-54
  3.1 A段的PCR扩增结果  36
  3.2 B段的PCR扩增结果  36-37
  3.3 ε毒素突变基因(mε)的PCR扩增结果  37-38
  3.4 重组质粒pMD18-T-mε的鉴定结果  38
  3.5 大肠杆菌重组质粒pET-28a-mε的鉴定结果  38-39
  3.6 重组大肠杆菌表达蛋白的鉴定  39-43
    3.6.1 SDS-PAGE鉴定结果  39-42
    3.6.2 表达产物westen blot鉴定结果  42-43
  3.7 间接ELISA法测定免疫兔血清抗体效价结果  43-44
  3.8 产气荚膜梭菌毒素D型培养上清致死量测定结果  44
  3.9 免疫兔血清抗体中和试验结果  44-45
  3.10 重组乳酸菌的鉴定结果  45-46
  3.11 重组乳酸杆菌表达蛋白的鉴定  46-48
    3.11.1 SDS-PAGE分析  46-47
    3.11.2 重组戊糖乳杆菌及重组干酪乳杆菌表达产物的western blot鉴定  47-48
  3.12 重组菌乳酸菌口服免疫小鼠特异性抗体检测结果  48-52
    3.12.1 免疫小鼠粪便中抗ε毒素的特异性sIgA检测结果  48-49
    3.12.2 免疫小鼠鼻腔冲洗液、阴道冲洗液中抗ε毒素特异性sIgA测定结果  49-51
    3.12.3 免疫小鼠血清中抗ε毒素的特异性IgG检测结果  51-52
  3.13 重组乳酸菌免疫小鼠攻毒试验结果  52-54
4 讨论  54-59
  4.1 构建产气荚膜梭菌mε毒素重组乳酸菌表达系统的立足点  54-55
  4.2 产气荚膜梭菌mε毒素在大肠杆菌中的表达及免疫效果的分析  55-56
  4.3 口服重组乳酸杆菌免疫效果的分析及评价  56-58
  4.4 本课题的研究思路与展望  58-59
5 结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-67
附录A：培养基的配制  67-69
附录B：主要试剂的配制  69-72
附录C：产气荚膜梭菌mε毒素全基因测序结果  72-73
攻读学位期间发表的学术论文  73

产气荚膜梭菌ε毒素突变基因重组乳酸杆菌的构建及其免疫学评价

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