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对酵母细胞色素C致死突变体sCc-M80A/F82H的研究

作　者: 彭欣杨
导　师: 刘湘军
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 细胞色素c 铁卟啉电子传递致死突变体动力学
分类号: Q559.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

细胞色素C是一种广泛存在于需氧生物细胞线粒体中的单链铁蛋白。它在生物体中的电子传递、抗氧化、促凋亡三个方面都起着至关重要的作用。因此对其的结构和生物学功能的研究都非常重要。而细胞色素C的轴向配位键结构对其的生物学功能的行使又是至关重要,因此我们的研究就集中于对细胞色素C铁卟啉环轴向配基位点上。在我们的前期的研究中,我们采用定点突变技术对细胞色素C铁卟啉环轴向配位键上的位点进行多种突变,而很多这样的突变在真核生物中是致死突变。这些致死突变对研究细胞色素C的结构和功能有着非同寻常的价值,但是在真核表达体系中很难大量表达这些致死突变体。本文并采用大肠杆菌表达体系,结合采用多种办法,成功大量表达出致死突变蛋白sCc-M80A/F82H。通过动力学研究,并与野生型的酵母细胞色素C进行比较,发现该突变蛋白氧化还原性质被大幅改变,变得极容易被氧化。本研究揭示了细胞色素C结构和功能的联系,为进一步了解轴向配位键的重要作用打下基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第1章引言  9-25
  1.1 细胞色素C 的基本知识  9-15
    1.1.1 细胞色素C  9
    1.1.2 细胞色素C 的功能  9-12
    1.1.3 细胞色素C 的保守性  12-13
    1.1.4 细胞色素C 轴向配位键  13-14
    1.1.5 酵母细胞色素C  14-15
    1.1.6 细胞色素C 致死突变体蛋白  15
  1.2 运用点突变技术研究细胞色素C  15-17
    1.2.1 定点突变技术  15-16
    1.2.2 点突变研究细胞色素C 及其现状  16-17
    1.2.3 突变位点的选择  17
  1.3 突变蛋白的表达体系介绍  17-20
    1.3.1 YEp13/GM-3C-2 表达体系  17-18
    1.3.2 pBTR1/BL21 表达体系  18-19
    1.3.3 两种表达体系的优劣性比较  19-20
  1.4 细胞色素C 的动力学研究  20-23
    1.4.1 细胞色素C 的紫外-可见光吸收谱  20-21
    1.4.2 自氧化反应  21
    1.4.3 与维生素C 的反应  21-22
    1.4.4 与CcP 的反应  22-23
  1.5 关于本课题的研究  23-25
第2章突变体蛋白的制备  25-45
  2.1 实验仪器设备  25-26
  2.2 主要实验材料与试剂  26
  2.3 重组质粒的构建  26-30
    2.3.1 提取含有突变基因的质粒  26-27
    2.3.2 PCR 引物设计  27
    2.3.3 PCR 扩增目的基因  27-28
    2.3.4 PCR 产物的酶切及回收纯化  28-29
    2.3.5 空白载体质粒的提取  29
    2.3.6 载体质粒的酶切、回收与去磷酸化  29-30
    2.3.7 载体与目的基因连接  30
  2.4 突变体蛋白的表达  30-34
    2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制作与重组质粒的转化  30-31
    2.4.2 阳性单克隆菌落的检验  31-32
    2.4.3 重组质粒的酶切鉴定与测序  32
    2.4.4 蛋白的最佳表达条件摸索  32-33
    2.4.5 收菌  33
    2.4.6 超声破菌  33-34
  2.5 蛋白的提取与纯化  34-38
    2.5.1 硫胺沉淀  34-36
    2.5.2 透析  36
    2.5.3 超滤  36-37
    2.5.4 阳离子交换  37-38
    2.5.5 SDS-PAGE 检测突变体蛋白  38
      2.5.5.1 SDS-PAGE 胶的制备  38
      2.5.5.2 胶的染色与脱色  38
  2.6 实验结果  38-45
    2.6.1 含有目的基因质粒及载体质粒的提取  38-39
    2.6.2 PCR 产物与空白载体质粒酶切后产物  39-40
    2.6.3 菌落PCR 鉴定重组质粒  40-41
    2.6.4 测序结果  41
    2.6.5 突变体蛋白的表达  41-42
    2.6.6 蛋白的纯化  42-43
    2.6.7 sCc-M80A/F82H 的SDS-PAGE  43-45
第3章 M80A/F82H 蛋白的相关性质及动力学研究  45-51
  3.1 实验仪器设备  45
  3.2 主要实验材料与试剂  45-46
  3.3 制备完全氧化态与完全还原态的细胞色素C  46-47
    3.3.1 制备全氧化（还原）态的细胞色素C  46
    3.3.2 细胞色素C 浓度及还原态蛋白比例的标定  46-47
  3.4 动力学研究实验  47-48
    3.4.1 空气中的自养化反应  47-48
    3.4.2 与维生素C 反应速率的测定  48
    3.4.3 与CCP 的反应  48
  3.5 实验结果  48-51
    3.5.1 制备完全氧化（还原）态的细胞色素C  48-49
    3.5.2 与维生素C 的反应  49
    3.5.3 自氧化反应和与CCP 的反应  49-51
第4章实验结论与前景展望  51-57
  4.1 蛋白质最佳表达条件  51-52
  4.2 sCc-M80A/F82H 是致死突变的原因分析  52-53
  4.3 sCc-M80A/F82H 特殊氧化还原性质的分析  53-55
  4.4 前景展望  55-57
参考文献  57-61
致谢  61-62
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  62

对酵母细胞色素C致死突变体sCc-M80A/F82H的研究

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