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鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析

作　者: 卢立志
导　师: 傅衍
学　校: 浙江大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 鸭卵泡 DSN 抑制性消减杂交 cDNA文库
分类号: S834
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

禽类的产蛋率,除了其他方面外,取决于等级前卵泡能被有效地募集进入等级卵泡,即通过卵泡的生长和闭锁建立卵泡等级。随着日龄的老化产蛋率的下降归因于卵泡闭锁的增加以及可供选择进入最后生长阶段(最大等级卵泡／排卵前卵泡)的小/生长卵泡数量减少。对人和哺乳动物巢卵泡发育研究表明,卵泡的生长和分化是多因素调控的复杂的生理生化过程,不仅受生殖轴内分泌激素的调控,而且卵巢中许多局部的生长、分化因子也以自分泌或旁分泌等形式发挥重要作用。目前,对于禽类卵泡发育的研究,虽然已经知道一些基因在不同发育阶段的卵泡中差异表达,但是对于复杂生命体而言,仅仅是其中很小部分,仍然没有合理假说来说明禽类卵泡等级的建立机制。通过筛选鸭卵泡差异表达的基因,比较不同发育阶段卵泡的差异表达基因,可以对这些差异基因在卵泡发育和分化过程中所发挥的作用有更深入的了解。揭示卵泡在不同生理状况下差异基因的表达情况,为进一步研究禽类性成熟、产蛋的启动、产蛋的维持和高产性能的分子生物学机制提供重要资料,并为最终揭示禽类卵泡发育和等级建立的分子机制,从而在基因水平上进行遗传操作,延长产蛋高峰期,提高鸭的产蛋率提供理论依据。本实验以产蛋高峰期绍兴鸭母鸭不同阶段的卵泡为实验材料,采用DSN酶介导的均一化消减杂交方法构建鸭卵泡差异表达基因的消减cDNA文库,以期找到与鸭卵泡发育相关的基因,探索卵泡等级建立与分化的基因表达调控的分子机制。本实验构建了两个鸭卵泡差异表达基因的双向消减文库：以最大等级卵泡和等级前卵泡这两个不同发育阶段的卵泡为实验材料进行消减杂交。其中,以最大等级卵泡为Tester,等级前卵泡为Driver,建立的为正向消减文库；以等级前卵泡为Tester最大等级卵泡为Driver建立的为反向消减文库。实验过程中,总RNA与反转录成的cDNA质量较好,消减产物得到很好的富集。正向消减文库中获得了88条独立的差异表达的基因,BLAST比对结果显示,其中60条具有同源基因,28条相似度极低或无同源性的基因。筛选出与卵泡发育相关基因LHR和EGFR,与细胞增殖和分化有关的基因SLC家族等,影响胚胎发育的NADH1α脱氢酶同源基因NADH1β几个编码激酶或其同源基因如PRKG2、 AKAP2、similar to protein kinase D1。此外,筛选到我们还分离了一些未知功能的基因。反向消减文库中获得了72条独立的差异表达的基因,BLAST比对结果显示,其中51条具有同源基因,21条无相似或者同源性极低的基因。筛选出的基因有RBMII,拼接因子SF2亚单位p32和U2AF35kDa subunit-like, tensin基因,真核生物翻译起始基因EIF3I,微管组分基因α-tubu1in,肠平滑肌肌动蛋白gamma2,含靶蛋白同源基因similar to palladin,免疫反应相关基因CD58,编码微小染色体维持蛋白的基因MCM5, RCC2,参与细胞侵袭和转移的基因Flotillin-2,酶类(包括激酶)及其同源基因AFG3ATPase f ami ly gene3-like2、AK3L2、TAOK3等基因。另外,我们还分离了一些未知功能的新基因。以最大等级卵泡和最小等级卵泡这两个不同发育阶段的卵泡为实验材料进行消减杂交。其中,以最大等级卵泡为Tester,最小等级卵泡为Driver,建立的为正向消减文库；以最小等级卵泡为Tester,最大等级卵泡为Driver建立的为反向消减文库。实验过程中,总RNA与反转录成的cDNA质量较好,消减产物得到很好的富集,正向消减文库中获得了79条独立的差异表达基因,BLAST比对结果显示,其中67条具有同源基因,12条无相似基因或者同源性极低的基因；筛选出与卵泡发育相关基因EGFR,与排卵有关的基因ADAMTS-1影响脑神经系统和胚胎发育的编码钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶基因、免疫相关基因lymphocyte antigen86-like和IL17RA,参与细胞调亡的基因death domain-containing tumor necrosis factor receptor superfamily member23,骨成形蛋白2基因。分离了一些编码通道或转运有关蛋白的基因及其同源基因sodium/myo-inositol cotransporter-like、calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase、 SLC9A8、potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member2、 SLC2A1、PCTP等。除上述基因外,还筛选到RNF14、TTC17、PHF21A、PLEKHB2、 ADD3、RGS12、SVEP1、HDAC4、STOM、SMARCE1、SETD4、CEBPG、STRADA、ZC3H14、 RHOBTB1、ALDH1A2、EXOC2和GAPVD等基因。反向消减文库中获得了37条独立的差异表达的基因,比对结果显示,其中29条具有同源基因,8条无相似或相似度极低的基因。反向文库中筛选出的基因主要包括RBMII、微管组分基因α-tubulin lc、 CD58、真核生物翻译起始基因EIF3I以及编码微小染色体维持蛋白的MCM5基因。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
第一部分文献综述  13-47
  第一章差异表达基因的研究方法及应用  13-37
    1 抑制性消减杂交技术在动物生殖与发育学上的应用  13-19
      1.1 SSH的原理  13-14
      1.2 SSH技术路线  14-15
      1.3 SSH的优缺点  15-17
      1.4 SSH技术在动物繁育研究中的应用  17-19
    2 mRNA差异显示技术及其在动物生殖生理研究中的应用  19-26
      2.1 DDRT-PCR技术原理  20
      2.2 DDRT-PCR技术的优点  20-21
      2.3 DDRT-PCR技术的缺点及其改进  21-22
      2.4 DDRT-PCR技术在动物发育研究中的应用  22-26
    3 基因表达系列分析及其在动物科学研究中的应用  26-31
      3.1 SAGE原理及操作步骤  26-27
      3.2 SAGE技术的优势,存在的问题及改进  27-30
      3.3 SAGE在动物科学研究中的应用  30-31
    4 基因芯片及其在动物基因研究中的应用  31-37
      4.1 基因芯片概述  31
      4.2 基因芯片主要技术流程  31-33
      4.3 基因芯片的改进  33
      4.4 基因芯片的应用  33-37
  第二章禽类卵泡发育调节的研究进展  37-47
    1 禽类卵巢及卵泡发育的结构特点  37
    2 禽类卵泡生长发育的调节  37-42
      2.1 促性腺激素释放激素(GnRH)对卵泡发育的调节  38
      2.2 促卵泡素(FSH)对卵泡发育的调节  38-39
      2.3 促黄体素(LH)对卵泡发育的调节  39
      2.4 雌激素对卵泡发育的调节  39
      2.5 孕激素对卵泡发育的调节  39-40
      2.6 促乳素(Prolactin,PRL)对卵泡发育的调节  40
      2.7 抑制素(INH)对卵泡发育的调节  40-41
      2.8 前列腺素(PG)对卵泡发育的调节  41
      2.9 8-精催产素对卵泡发育的调节  41
      2.10 细胞因子对卵泡发育的调节  41-42
      2.11 褪黑素(MLT)对卵泡发育的调节  42
      2.12 肾上腺皮质激素对卵泡发育的调节  42
    3 卵泡闭锁的调节  42-44
    4 禽类卵巢卵泡与产蛋  44-47
第二部分实验研究  47-123
  第三章鸭最大等级卵泡与等级前卵泡正反消减文库的构建  47-92
    1 材料与方法  47-53
      1.1 实验材料  47
      1.2 实验试剂  47
      1.3 主要试剂的配制  47-48
      1.4 实验仪器  48-49
      1.5 样品总RNA提取  49
      1.6 DSN介导的消减杂交  49-53
    2 结果与分析  53-78
      2.1 总RNA的结果检测  53-54
      2.2 cDNA的合成质量检测  54-55
      2.3 消减产物的PCR扩增结果  55-57
      2.4 消减效率检测  57-58
      2.5 消减文库cDNA的检测  58-65
      2.6 测序与序列分析  65-78
    3 讨论  78-91
      3.1 关于抑制消减杂交技术  78-80
      3.2 关于引物的设计  80-82
      3.3 关于差异表达的基因  82-91
    4 小结  91-92
  第四章鸭最大与最小等级卵泡正反消减文库的构建  92-123
    1 材料与方法  92
      1.1 实验材料  92
      1.2 实验试剂  92
      1.3 主要试剂的配制  92
      1.4 实验仪器  92
      1.5 样品总RNA提取  92
      1.6 DSN介导的消减杂交  92
    2 结果与分析  92-115
      2.1 总RNA的结果检测  93
      2.2 cDNA的合成质量检测  93-94
      2.3 消减产物的PCR扩增结果  94-96
      2.4 消减效率检测  96-98
      2.5 消减文库cDNA的检测  98-104
      2.6 测序与序列分析  104-115
    3 讨论  115-122
      3.1 文库消减文库中重要的差异表达基因  115-121
      3.2 文库间差异基因的比较  121-122
    4 小结  122-123
第六章创新点  123-124
参考文献  124-150
致谢  150-151
缩略词表  151-152
攻读博士学位期间发表的论文  152

鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析

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