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番鸭GnRHR基因全长cDNA克隆、时空表达及对产蛋性能的关联研究

作　者: 彭亮
导　师: 李昂; 吴旭
学　校: 福建农林大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 番鸭 GnRHR基因 cDNA克隆 时空表达 多态性
分类号: S834
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


为了研究番鸭就巢机理，选择与繁殖性能密切相关的促性腺激素释放激素受体（GnRHR）基因作为研究对象，利用RT-PCR和RACE技术克隆GnRHR基因的全长cDNA序列；使用多种生物信息学软件对该基因核酸序列及对应编码的蛋白序列进行分析，为开展对该基因功能的分子机制的研究提供理论基础；根据番鸭GnRH基因序列和克隆的GnRHR基因cDNA序列，在它们的保守区设计特异性引物，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）为内参基因，通过建立Real-time PCR检测方法，统计分析两种基因在番鸭不同组织、不同时期的表达差异性，研究就巢期的表达规律；采用覆盖法，在得到的全长cDNA基础上获得GnRHR基因的DNA序列，利用PCR-SSCP和PCR-RFLP两种方法检测GnRHR基因的多态性，并分析与番鸭产蛋性能之间的关联性。试验结果如下：1.在番鸭垂体中成功克隆GnRHR基因，该基因全长cDNA为1680bp，其中，氨基酸编码区长为1248bp，可编码415个氨基酸。通过不同物种序列比对和同源性分析，该基因与原鸡和火鸡的核酸序列同源性，分别为90%和88%；与原鸡的氨基酸序列同源性为88%，系统进化树分析显示，番鸭垂体GnRHR基因属于Ⅱ型。蛋白结构分析结果表明GnRHR含有1个G-protein coupled receptorsfamily1结构域，具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体家族。二级结构预测发现蛋白有48.43%的α螺旋、6.02%的β折叠、45.54%的无规则卷曲结构，同源建模得到三维结构。2. GnRHR基因在番鸭下丘脑、垂体和性腺组织中表达量较高，该三种组织的表达量显著高于肌胃、胰脏、心脏、十二指肠、脾脏、肝脏和腺胃的表达（P＜0.05）。在番鸭HPG轴上研究GnRHR和GnRH两个基因不同时期的表达差异，结果表明对于母番垂体鸭GnRHR基因在产蛋期（36周）表达量最高，显著高于其他时期（P＜0.05），下丘脑和卵巢的表达与垂体相似；垂体的GnRH基因在性成熟期（23周）和产蛋期（36周）表达较高，且两者差异不显著（P＞0.05），在下丘脑和卵巢的表达也与垂体相似。但对于公鸭垂体GnRHR基因在性成熟期（23周）表达量最高，且显著高于其他时期（P＜0.05），下丘脑和睾丸的表达与垂体相似；GnRH基因的表达与母番鸭的相似。3.测序得到番鸭GnRHR基因的DNA序列有三个内含子，在内含子2的片段GR1上检测到一个位点的碱基突变，为CT突变；检测分析发现存在AA、AB和BB三种基因型，不同基因型与开产日龄、最长连产天数、平均连产天数和300日龄产蛋数显著相关（P＜0.05）。

全文目录


摘要  9-10
Abstract  10-12
第一章 文献综述  12-24
  1 背景概述  12-14
    1.1 家禽就巢行为的调控机理  12-13
    1.2 下丘脑-垂体-性腺轴的调控机理  13-14
  2 GnRHR 基因的研究概述  14-18
    2.1 G 蛋白偶联受体的简介  14-15
    2.2 GnRH 结构特点  15
    2.3 GnRHR 种类和结构特点  15-16
    2.4 GnRHR 介导的细胞转导机制  16
    2.5 GnRHR 基因的表达调控  16-17
    2.6 GnRHR 生物学意义  17-18
      2.6.1 GnRHR 对于神经调节的作用  17
      2.6.2 GnRHR 对于机体组织的作用  17
      2.6.3 GnRHR 基因与畜禽繁殖性能的关系  17-18
  3 cDNA 末端快速克隆技术研究概述  18-20
    3.1 RACE 技术的基本原理  18-20
    3.2 RACE 的应用及其前景  20
  4 实时荧光定量 PCR 技术研究概述  20-21
  5 DNA 标记技术研究概述  21-22
  6 本研究的目的、创新点与意义  22-24
第二章 番鸭 GnRHR 基因全长 cDNA 的克隆和生物信息学分析  24-42
  1 材料和方法  24-30
    1.1 试验动物  24
    1.2 试剂和仪器  24
      1.2.1 试剂  24
      1.2.2 主要仪器  24
    1.3 引物设计与合成  24-25
    1.4 全长 cDNA 序列获取方法  25-30
      1.4.1 番鸭垂体总 RNA 的获得  25
      1.4.2 部分 cDNA 序列获得  25-27
      1.4.3 3’-RACE  27-28
      1.4.4 5’-RACE  28-30
      1.4.5 RACE 序列验证  30
      1.4.6 序列生物信息学分析  30
  2 结果和分析  30-40
    2.1 垂体 Total RNA 的纯度检测结果  30-31
    2.2 番鸭 GnRHR 基因部分 cDNA 序列获得结果  31-32
      2.2.1 PCR 反应液检测结果  31
      2.2.2 番鸭 GnRHR 基因部分 cDNA 序列分析  31-32
    2.3 GnRHR 基因全长 cDNA 序列结果  32-34
      2.3.1 3’-RACE 和 5’-RACE 的电泳检测和测序结果  32-33
      2.3.2 番鸭 GnRHR 基因全长 cDNA 序列的获得  33-34
      2.3.3 RACE 序列验证  34
    2.4 GnRHR 基因序列同源性分析  34-37
    2.5 编码蛋白的基本理化性质分析  37-38
    2.6 编码蛋白结构分析  38-40
  3 讨论  40-42
第三章 番鸭 GnRHR 和 GnRH 基因的时空表达研究  42-56
  1 材料与方法  42-45
    1.1 试验动物和器官组织选择  42
    1.2 主要试剂和仪器  42
      1.2.1 主要试剂  42
      1.2.2 主要仪器  42
    1.3 引物设计及合成  42-43
    1.4 总 RNA 的提取与反转录  43-44
      1.4.1 组织总 RNA 的提取和检测方法同试验一  43
      1.4.2 cDNA 的合成  43-44
    1.5 Real-time PCR 反应的优化  44
      1.5.1 扩增产物特异性检测  44
      1.5.2 Real-time PCR 应条件的优化  44
    1.6 标准曲线的建立  44-45
    1.7 样品的检测  45
    1.8 数据的处理及分析  45
  2 结果与分析  45-53
    2.1 番鸭组织总 RNA 的完整性和纯度检测  45-46
    2.2 扩增产物特异性结果  46
    2.3 Real-time PCR 的标准曲线结果  46-48
    2.4 Real-time PCR 的熔解曲线及扩增曲线结果  48-50
    2.5 Real-time PCR 检测结果  50-53
      2.5.1 GnRHR 基因在番鸭不同生长阶段不同组织表达水平  50-51
      2.5.2 GnRH 基因在 HPG 轴组织上不同时期的表达水平  51-53
  3 讨论与分析  53-56
    3.1 Real-time PCR 检测方法的建立  53-54
    3.2 GnRHR 基因表达部位及影响  54-55
    3.3 GnRH 及受体基因的表达特征及对就巢行为的影响  55-56
第四章 番鸭 GnRHR 基因多态性及其与产蛋性状关联分析  56-66
  1 材料  56
    1.1 试验对象  56
    1.2 仪器与试剂  56
      1.2.1 主要仪器设备  56
      1.2.2 主要试剂及配置  56
    1.3 分析软件和工具  56
  2 试验方法  56-61
    2.1 基因组 DNA 提取  56-57
    2.2 DNA 纯度和浓度检测  57-58
      2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测  57-58
      2.2.2 紫外分光光度计检测  58
    2.3 GnRHR 基因的 PCR 扩增  58-59
      2.3.1 PCR 引物设计  58
      2.3.2 PCR 反应条件  58-59
      2.3.3 PCR 产物的琼脂糖电泳检测和测序分析  59
    2.4 单核苷酸多态性检测  59-60
      2.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 SSCP 分析  59-60
      2.4.2 硝酸银染色法洗胶  60
      2.4.3 基因型的判定和测序  60
    2.5 多态性检测  60
      2.5.1 限制性内切酶片段长度多态性检测  60
      2.5.2 PCR-SSCP 检测  60
    2.6 数据处理及分析  60-61
      2.6.1 基因频率和基因型频率  60-61
      2.6.2 基因多态性与番鸭产蛋性能的关联分析  61
  3 结果  61-64
    3.1 番鸭基因组 DNA 的提取效果  61
    3.2 番鸭 GnRHR 基因 DNA 序列的获取  61-62
    3.3 番鸭 GnRHR 基因的单核苷酸多态位点（SNPs）检测  62-63
    3.4 番鸭 GnRHR 基因多态性检测  63
    3.5 番鸭 GnRHR 基因的群体遗传学分析  63-64
  4 分析与讨论  64-66
    4.1 GnRHR 基因内含子和多态性  64
    4.2 GnRHR 基因对产蛋性能的影响  64-66
全文结论  66-68
参考文献  68-77
致谢  77-78
附录  78-81

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸭
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