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五个新的鸭β-防御素的分离、鉴定及其抗病毒机制的初探

作　者: 张可心
导　师: 马得莹
学　校: 东北农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 鸭β-防御素抗菌活性抗病毒活性诱导表达信号转导
分类号: S834
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

防御素是广泛存在于动植物体内的一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,具有抑制细菌、真菌和囊膜病毒的作用,其独特的抗菌机制避免了传统抗生素易使细菌产生耐药性等问题,有望代替抗生素成为新型的饲料添加剂。禽抗菌肽属于β-防御素类,具有高效、广谱的抗菌活性,在禽类先天性免疫系统中发挥着重要作用。本研究采用RT-PCR方法,分别从鸭肺脏和骨髓组织中扩增到5个新的β-防御素基因,将测序结果与已发现的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树并进行同源性分析。结果显示,这5个基因分别是鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5,鸭AvBD6和鸭AvBD16。其中,鸭AvBD1cDNA大小为198bp,编码65个氨基酸,与鸵鸟AvBD1氨基酸同源性最高为78%；鸭AvBD3cDNA大小为182bp,编码60个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性高达100%；鸭AvBD5cDNA大小为201bp,编码66个氨基酸残基,与鸡AvBD5氨基酸同源性达97%；鸭AvBD6cDNA大小为204bp,编码67个氨基酸残基,与鸡AvBD6氨基酸同源性高达100%；鸭AvBD16cDNA大小为155bp,编码50个氨基酸,与鸡AvBD3同源性最高,为62%。将这5个鸭AvBD基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21,进行IPTG诱导表达。将表达的蛋白进行纯化,同时根据其各自的氨其酸序列分别合成相应的5条多肽。以4种革兰氏阳性菌和8种革兰氏阴性菌为检测菌,采用菌落计数法测定重组和合成的鸭AvBD1、3、5、6、16和GST蛋白的抗菌活性,以及盐离子浓度对其抗菌活性的影响。并对这些蛋白的溶血活性进行测定。结果表明,与GST标签蛋白相比,重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白对12种细菌均有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。在高盐浓度下,这些蛋白对四联球菌和多杀性巴氏杆菌的抗菌活性显著降低(P<0.05或P<0.01)。此外,这些蛋白溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异(P>0.05)。本试验还测定了这5个重组蛋白的体外抗鸭肝炎病毒作用,结果表明,与阳性对照(病毒组)相比,这些重组蛋白显著延长了鸭胚的存活时间(P<0.05或P<0.01),相反地,GST无显著作用(P>0.05),表明这些重组蛋白具有抗鸭肝炎病毒的作用。为探讨这些鸭AvBDs基因在体内组织中的表达水平是否受鸭肝炎病毒诱导,及其抗病毒作用的信号转导机制。本研究以鸭肝炎病毒感染鸭,采用荧光定量PCR方法,分别检测了攻毒后24h、32h、48h、72h、96h鸭体内法氏囊、脾脏、胸腺、盲肠扁桃体、骨髓、肝脏、肾脏和肺脏组织中这5个鸭AvBDs基因的表达量,以及几个细胞因子：鸭白介素-2(IL-2)、白介素-18(1L-18)和γ干扰素(IFN-γ),以及Toll样受体7(TLR7)基因在除肾脏和肺脏外的上述组织中的表达量。结果显示,经鸭肝炎病毒诱导后,除鸭AvBD1、3年和IFN-γ在肝脏中没有被诱导表达外,其余基因在肝脏组织中均被诱导表达或表达量显著上调(P<0.05或P<0.01)。此外,在攻毒后的各个时间点,也检测到这些基因在其他组织中发生诱导表达或表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01)。同时,本试验结果还显示,这些防御素和细胞因子在组织中的表达量与TLR7的表达量呈正相关。上述结果揭示,这些鸭AvBDs与细胞因子在体内的抗病毒作用可能受TLR7介导的信号转导通路调控。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 引言  12-19
  1.1 防御素的研究进展  12-14
    1.1.1 防御素的定义及分类  12-13
    1.1.2 防御素的生物学作用及其机制  13-14
  1.2 禽防御素的研究进展  14-17
    1.2.1 禽防御素分子结构  15
    1.2.2 禽防御素蛋白的表达  15
    1.2.3 禽防御素的生物学特性  15-16
    1.2.4 禽防御素的组织分布及诱导性表达  16-17
  1.3 防御素抗感染的信号转导机制  17-18
  1.4 鸭肝炎病毒  18
  1.5 研究目的与意义  18-19
2 材料与方法  19-33
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 菌株、载体质粒及重组蛋白  19
    2.1.2 试剂与仪器  19-20
    2.1.3 实验动物  20
    2.1.4 实验动物样品  20
  2.2 鸭AvBD基因的克隆与序列分析  20-25
    2.2.1 组织总RNA的提取  20-21
    2.2.2 反转录(RT)  21
    2.2.3 聚合酶链式反应(PCR)  21-22
    2.2.4 PCR产物的回收  22
    2.2.5 PCR产物的连接  22-23
    2.2.6 感受态细胞的制备  23
    2.2.7 连接产物的转化  23
    2.2.8 重组质粒的提取  23-24
    2.2.9 重组质粒的鉴定  24
    2.2.10 序列分析及同源性比较  24-25
  2.3 重组鸭AvBD1、5和16蛋白在原核中的表达  25-28
    2.3.1 原核表达载体的构建与测序  25-27
    2.3.2 重组鸭AvBD1、5和16蛋白的诱导表达  27-28
    2.3.3 重组鸭AvBD1、5和16蛋白的纯化  28
  2.4 鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白的合成  28-29
  2.5 重组与合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白的抗菌活性测定  29
  2.6 盐离子浓度对重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白抗菌活性的影响  29
  2.7 重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白对鸭红细胞的溶血活性  29
  2.8 重组鸭AvBD1、3、5、6和16的体外抗病毒活性的测定  29-30
  2.9 检测鸭AvBDs、IL-2、IL-18、IFN-γ、TLR-7经鸭肝炎病毒诱导后的组织表达差异  30-32
    2.9.1 实验动物及组织样品的采集  30
    2.9.2 cDNA模板和标准品的制备  30-31
    2.9.3 检测鸭AvBDs、IL-2、IL-18、IFN-γ、TLR-7组织表达差异  31-32
  2.10 数据统计与分析  32-33
3 结果与分析  33-58
  3.1 鸭AvBD1、3、5、6和16基因的克隆  33-34
  3.2 测序结果与分析  34-36
  3.3 鸭AvBD1、3、5、6和16基因的遗传进化分析  36-38
  3.4 重组鸭AvBD1、5和16蛋白的原核表达与纯化  38-42
    3.4.1 表达用重组质粒pMD18-duckAvBD1、5和16的鉴定  38-39
    3.4.2 重组表达质粒pGEX-duckAvBD1、5、16的鉴定  39-40
    3.4.3 重组鸭AvBD1、5和16蛋白的原核表达与纯化  40-42
  3.5 重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白的抗菌活性  42
  3.6 盐离子浓度对重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白抗菌活性的影响  42-46
  3.7 重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白对鸭红细胞的溶血活性  46
  3.8 重组鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白的抗病毒活性  46-47
  3.9 鸭AvBDs、1L-2、IL-18、IFN-γ、TLR-7经鸭肝炎病毒诱导后的组织表达差异  47-58
4 讨论  58-62
  4.1 鸭AvBD1、3、5、6和16基因的克隆与遗传进化分析  58
  4.2 重组鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白的原核表达  58-59
  4.3 重组和合成鸭AvBD1、3、5、6和16蛋白的生物学特性  59-60
  4.4 鸭AvBDs、IL-2、IL-18、IFN-γ、TLR-7经鸭肝炎病毒诱导后的组织表达差异  60-62
5 结论  62-63
致谢  63-64
参考文献  64-71
附录  71-75
攻读硕士学位期间发表的学术论文  75

五个新的鸭β-防御素的分离、鉴定及其抗病毒机制的初探

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