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牛Nramp1基因N端单克隆抗体的制备及鉴定

作　者: 徐晓彬
导　师: 靳亚平
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: Nramp1-N蛋白 诱导表达 蛋白纯化 单克隆抗体 鉴定
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 28次
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内容摘要


天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1（Natural resistance-associated macrophage protein 1,Nramp1）,是一种在有吞噬功能细胞（如巨噬细胞、噬中性粒细胞）中特异性表达的蛋白,具有二价金属离子转运功能。Nramp1定位于晚期胞内体上,主要通过将满足病原微生物自身营养代谢或合成防御体系所必须的金属离子(如Fe2+、Mn2+)从吞噬体内转运到胞液中而实现对病原微生物的抑制,从而增强机体抵御胞内病原微生物的能力。为了检测Nramp1的转基因细胞、胚胎,培育抗胞内病原微生物（如结核杆菌、布鲁氏杆菌等）的转基因牛及后续对转基因牛的检测鉴定。我们制备了牛Nramp1-N单克隆抗体（McAb）。本试验结果如下:1筛选了诱导表达Nramp1-N蛋白的最佳培养条件,结果证明:在35℃摇床培养条件下,IPTG的终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为10 h时,Nramp1-N蛋白的表达量相对最大。使用AKTA蛋白纯化系统得到纯度较高的目的蛋白。2用纯化的Nramp1-N蛋白免疫Balb/c小鼠和家兔,采用间接ELISA方法来检测免疫后小鼠和家兔的血清抗体效价,小鼠的血清抗体效价超过1∶1×105,而兔的血清抗体效价达到1∶1×106。3融合骨髓瘤细胞和免疫脾细胞后,采用间接ELISA法检测阳性克隆孔,检测结果:细胞克隆率达到29.2 %,阳性细胞克隆率达到46.4 %。使用有限稀释法克隆筛选后得到了两株阳性杂交瘤细胞,并分别命名为D3和F6。采用ELISA和Western Blot方法对McAb进行特异性鉴定,结果证明所获得的两株细胞株所分泌的抗体均是针对Nramp1-N蛋白的单克隆抗体。使用秋水仙素对杂交瘤细胞进行核型分析,通过观察100个中期杂交瘤细胞,统计后每个杂交瘤细胞染色体平均数目53±2对。4应用间接ELISA方法检测所获得的细胞株培养上清和腹水的效价,D3和F6细胞培养上清效价分别为1:500和1:200;小鼠腹水效价分别为1:1×105和1:1×104。经反复冻存和传代培养后,证明其均具有稳定分泌抗体的能力。D3和F6所分泌的McAb的亲和常数分别为2×108,2×107。D3和F6细胞株分泌的抗体分别属于IgG1/κ、IgM/κ类型。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章 Nramp1 和单克隆抗体的研究进展  9-18
  1.1 Nramp1 研究进展  9-12
    1.1.1 基因交互作用与结核病的关系  9-10
    1.1.2 Nramp1 和DMT1 与机体铁转运的关系  10-11
    1.1.3 Nramp1、iNOS 与副结核  11-12
  1.2 单克隆抗体研究进展  12-18
    1.2.1 历史展望  12-14
    1.2.2 单克隆技术的研究  14-18
第二章 Nramp1-N 融合蛋白的表达、纯化及其免疫效果  18-26
  2.1 材料与方法  18-20
    2.1.1 主要试剂  18
    2.1.2 主要仪器设备  18-19
    2.1.3 试验动物及菌株  19
    2.1.4 试验方法  19-20
  2.2 结果与分析  20-24
    2.2.1 Nramp1-N 融合蛋白的最佳表达条件筛选及可溶性分析  20-22
    2.2.2 Nramp1-N 融合蛋白的纯化  22-23
    2.2.3 Nramp1-N 融合蛋白浓度测定结果  23
    2.2.4 Nramp1-N 融合蛋白免疫原性的测定  23-24
  2.3 讨论  24-25
    2.3.1 Nramp1-N 蛋白原核表达优化  24
    2.3.2 Balb/c 小鼠免疫程序的优化  24-25
  2.4 小结  25-26
第三章 抗Nramp1-N 单克隆杂交瘤株的建立  26-33
  3.1 材料和方法  26-29
    3.1.1 主要试剂  26
    3.1.2 主要仪器设备  26-27
    3.1.3 实验动物及细胞  27
    3.1.4 试验方法  27-29
  3.2 结果与分析  29-31
    3.2.1 骨髓瘤细胞的制备  29
    3.2.2 饲养层细胞的制备  29-30
    3.2.3 细胞融合  30
    3.2.4 杂交瘤细胞株的筛选  30
    3.2.5 单克隆抗体特异性测定  30-31
  3.3 讨论  31-32
  3.4 小结  32-33
第四章 抗Nramp1-N 的单克隆抗体的制备及鉴定  33-43
  4.1 材料和方法  33-37
    4.1.1 主要试剂  33
    4.1.2 主要仪器设备  33
    4.1.3 试验动物及细胞  33-34
    4.1.4 试验方法  34-37
  4.2 结果与分析  37-41
    4.2.1 杂交瘤细胞的复苏和冻存  37
    4.2.2 腹水中抗体蛋白含量的测定  37
    4.2.3 单克隆抗体杂交瘤细胞上清和腹水单抗效价的测定  37-38
    4.2.4 单克隆抗体亚型的测定  38
    4.2.5 结合位点分析  38
    4.2.6 杂交瘤细胞染色体分析  38-39
    4.2.7 单克隆抗体的特异性检测  39-40
    4.2.8 单克隆抗体亲和常数测定  40-41
  4.3 讨论  41-42
    4.3.1 单克隆抗体性质的分析  41
    4.3.2 单克隆抗体亚型  41
    4.3.3 单克隆抗体特异性检测  41-42
    4.3.4 抗原结合位点分析  42
  4.4 小结  42-43
结论  43-44
参考文献  44-52
致谢  52-53
作者简介  53

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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