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鸭脂肪组织EST鉴定、脂肪代谢相关基因多态检测及其与肉鸭脂肪、屠体和生长性状的关联分析

作　者: 杨永平
导　师: 龚炎长
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 肉鸭 EST SNP 脂肪性状屠体性状体重
分类号: S834
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

最近几十年,肉鸭育种在提高生长速度、降低屠宰日龄等方面取得了令人瞩目的成绩,但在高强度选择提高生长速度的同时,出现了体脂、尤其是皮下脂肪和腹脂沉积过多的问题。随着人们生活水平的不断提高,由于脂肪摄入过多而产生的各种疾病已引起广泛关注；另外,过多的脂肪沉积不仅会影响产品的外观以及肉品质、降低生产效率,同时也会增加加工过程中的损耗从而影响经济效益；这些问题在一定程度上制约了肉鸭业的发展。因此,控制脂肪在鸭体内的过多蓄积,选育低脂肉鸭品种是今后肉鸭育种的奋斗目标之一。肉鸭的脂肪性状属于数量性状,受多基因控制,标记辅助选择是一种简便、有效的性状改良方法,通过与性状关联的分子遗传标记,选择控制相关性的候选基因的基因型,可实现标记辅助选择。但目前利用候选基因法在鸭中筛选分子标记,存在缺乏必要的基因序列信息的问题,本研究一方面利用基因组饱和杂交的原理,通过构建鸭脂肪组织均一化cDNA文库、测序获得在鸭脂肪组织中表达的新序列并借助序列分析寻找与鸭脂肪沉积相关的候选基因,为在鸭中开展新基因鉴定和基因功能研究提供序列基础；另一方面运用PCR-SSCP,DNA测序和PCR-RFLP结合的方法寻找和鉴定鸭脂肪性状候选基因LPL、ADP和GH基因的SNP,并借助SNP分析这些基因与鸭脂肪、屠体和生长体重等性状间的关系,为寻找可用于鸭标记辅助选择育种的分子遗传标记奠定基础,为进行高效的低脂鸭育种提供参考。主要研究结果如下：1.鸭脂肪组织EST的鉴定(1)首先构建了鸭皮脂和腹脂的两个独立cDNA文库,腹脂独立文库所含克隆数目约为4.8×106,文库重组率约为97%；皮脂独立文库所含克隆数目约为2.48x106,文库重组率约为94%,独立文库质量较好,满足均一化的要求。(2)采用基因组DNA饱和杂交法,构建了鸭脂肪组织均一化cDNA文库。均一化后文库插入片段约700bp；在测序所得的234条EST序列中,单一序列有188条,占80%；在NCBI核酸数据库中无同源的新序列有93条,占40%；对测序所得EST序列的BLASTN分析发现共有141条序列在数据库中有同源序列,其中79条序列有同源基因的信息。(3)分析与这些EST同源的基因功能发现,它们包括DNA或RNA水平上的相关调节因子、结构蛋白、细胞分化与凋亡因子、转座子、免疫因子、性别决定相关因子、信号转导因子、线粒体基因和原癌基因,以及一些蛋白质代谢、视觉和肌肉发育、脂质代谢相关基因等,还有一些功能未知的同源基因。这些功能基因的表达也暗示脂肪组织并不仅仅只是一个储存和释放能量的组织,而是一个重要而且活跃的器官,广泛地参与了机体的生理活动过程。(4)获得了与脂质代谢相关的鸭LPL基因1326bp的cDNA序列(GenBank accessionno.FJ859348),该序列基本包括了鸭LPL基因的CDS区域,可用于下一步的SNP筛选。2.鸭脂肪代谢相关候选基因LPL、GH和WADP的多态性检测及关联分析运用PCR-SSCP,DNA测序和PCR-RFLP结合的方法,对LPL、GH和ADP等三个基因进行SNP筛选或确认。利用来自武汉精武食品工业园有限公司精武优质肉鸭场的白改鸭×连城白鸭F2群体资料,分析了上述SNP部分位点与鸭脂肪、屠体和生长体重等性状间的关系,主要研究结果如下：(1)通过PCR-SSCP和测序方法,在LPL基因(GenBank accession no.FJ859348)中发现了5个新的SNP：外显子2存在一个C150T点突变,该突变造成Eco24Ⅰ酶切位点的改变；外显子5存在三个点突变,分别为C645T,T708C和G726A突变,其中C645T造成Sac Ⅱ酶切位点改变,G726A造成Mva Ⅰ酶切位点改变；外显子8存在一个C1245T点突变。这5个SNP在鸭LPL基因中的分布位置提示外显子5可能是一个突变多发区域。利用PCR-RFLP方法,对C645T和G726A两个SNP位点进行了酶切分型,并将基因型与鸭脂肪、屠体和体重性状进行了关联分析,结果显示：①在公鸭中,CT(AG)基因型的腹脂重、皮脂重均显著或极显著高于CC(GG)基因型(P<0.05或P<0.01)；在母鸭中,TT(AA)基因型的皮脂重极显著高于CC(GG)基因型(P<0.01),而且TT(AA)基因型的腹脂重也高于CC(GG)基因型,接近显著水平(P=0.06)；②在公鸭中,CT(AG)基因型的屠体性状值均极显著高于CC(GG)基因型(P<0.01)；在母鸭中,除头重差异不显著外(P>0.05),TT(AA)基因型的屠体性状值均显著或极显著高于CC(GG)基因型(P<0.05或P<0.01)；③在公鸭中,前8周体重在基因型间差异不显著(P>0.05),从第8周到第12周,CT(AG)基因型的体重极显著高于CC(GG)基因型；在母鸭中,前4周体重差异不显著(P>0.05),从第4周到第12周,TT(AA)基因型的体重均显著或极显著高于CC(GG)基因型(P<0.05或P<0.01)。另外,从LPL基因不同基因型在公母鸭的分布发现,该基因可能存在于鸭的Z染色体上。(2)利用PCR-RFLP方法,对鸭GH基因(GenBank accession no. AB158760) C3701T突变位点进行了鉴定,发现本实验群中也存在该突变。酶切分型后将基因型与鸭脂肪、屠体和体重性状进行了关联分析,结果显示：①GH基因三种基因型间腹脂重差异显著(P<0.05),皮脂重差异极显著(P<0.01),基因型间腹脂重与皮脂重从大到小均为COCT>TT。②三种基因型间活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、腿肌重、胸肌重、头重、脖子重、翅膀重、鸭掌重、心重、肝重和肌胃重等屠体性状均差异极显著(P<0.01),性状值在基因型间从大到小为COCT>TT。③第2周到第4周、第8周到第12周基因型间体重差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)第六周体重在基因型间的差异接近显著水平(P=0.074)。除初生重外,体重性状值在基因型间从大到小依次为COCT>TT。(3)利用PCR-RFLP方法,对ADP基因(GenBank accession no. DQ452618.1) C540T和C579T两个突变位点进行了鉴定,发现C579T位点在本实验群中未产生突变,该位点在本实验群中均为CC型；C540T突变位点在本实验群中存在分离。对该突变位点酶切分型后将基因型与鸭脂肪、屠体和体重性状进行了关联分析,结果显示：①基因型间脂肪性状差异不显著(P>0.05)；②活重、胸肌重、头重、肌胃重、心重和肝重等在基因型间差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),屠体重、半净膛重、全净膛重和翅膀重等屠体性状基因型间的差异均接近显著水平(P=0.054-0.073),腿肌重、脖子重和鸭掌重基因型间差异不显著(P>0.05)；③后期体重(8-10周)在基因型间差异显著；TT基因型体重值从初生重至第10周均高于其他两种基因型的体重值。

全文目录

缩略词表  8-10
摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
第一章文献综述  17-32
  1 我国养鸭业现状及存在的问题  17-19
  2 EST的概念、应用及获得方法  19-23
    2.1 EST的概念和特点  19-20
    2.2 EST的应用  20-21
    2.3 构建均一化cDNA文库是获得新EST的有效方法  21-23
      2.3.1 复性式均一化方法  21-22
      2.3.2 基因组饱和杂交法  22-23
  3 候选基因法  23-24
  4 与禽类脂肪代谢相关的候选基因  24-29
    4.1 脂蛋白脂酶基因  24-25
    4.2 脂联素基因  25
    4.3 生长激素基因  25-26
    4.4 肥胖基因与瘦蛋白受体基因  26-27
    4.5 脂肪酸结合蛋白基因  27
    4.6 过氧化物酶体增殖物激活受体基因  27-28
    4.7 脂肪酸合成酶基因  28
    4.8 解偶联蛋白基因  28-29
  5 SNP及其特点  29-30
  6 本研究的目的与意义  30-32
第二章鸭脂肪组织均一化文库构建及EST鉴定  32-50
  1 前言  32
  2 材料与方法  32-42
    2.1 材料  32-34
      2.1.1 实验样品  32
      2.1.2 主要实验仪器和设备  32
      2.1.3 主要试剂(盒)、载体及菌株  32-34
      2.1.4 常用试剂及溶液配制  34
    2.2 方法  34-42
      2.2.1 独立cDNA文库构建  34-37
      2.2.2 DNA亲和体系构建  37-40
      2.2.3 饱和杂交  40
      2.2.4 洗脱  40-41
      2.2.5 转化  41-42
  3 结果  42-46
    3.1 独立cDNA文库构建  42-44
      3.1.1 腹脂和皮脂的总RNA质量和浓度检测  42-43
      3.1.2 cDNA合成  43-44
      3.1.3 独立cDNA文库的质量鉴定  44
    3.2 均一化cDNA文库  44-45
    3.3 测序及序列分析  45-46
  4 讨论  46-48
    4.1 均一化cDNA文库的质量评价及序列分析  46-47
    4.2 鸭脂肪组织具有重要的内分泌功能  47
    4.3 利用基因组饱和杂交原理构建均一化文库的技术优化  47-48
  5 小结  48-50
第三章鸭脂肪代谢相关候选基因LPL、GH和ADP的多态性检测及性状关联分析  50-76
  1 前言  50
  2 材料与方法  50-59
    2.1 材料  50-52
      2.1.1 实验动物与样品采集  50-51
      2.1.2 主要实验仪器和设备  51
      2.1.3 主要试剂  51
      2.1.4 主要试剂和溶液的配制  51-52
    2.2 方法  52-59
      2.2.1 鸭基因组DNA的提取与检测  52
      2.2.2 候选基因多态性检测及基因分型  52-59
      2.2.3 数据统计与分析  59
  3 结果  59-71
    3.1 LPL基因多态性检测及其与脂肪、屠体和体重性状的关联分析  59-64
      3.1.1 LPL基因PCR产物的获得  59-60
      3.1.2 PCR-SSCP检测LPL多态性  60
      3.1.3 克隆、测序及序列分析  60-61
      3.1.4 PCR-RFLP酶切分型  61-62
      3.1.5 LPL基因与脂肪、屠体和体重性状的关联分析  62-64
    3.2 ADP基因多态性检测及与脂肪、屠体和体重性状的关联分析  64-68
      3.2.1 ADP基因PCR产物的获得  64-65
      3.2.2 ADP基因多态性检测及PCR-RFLP酶切分型  65-66
      3.2.3 ADP基因与脂肪、屠体和体重性状的关联分析  66-68
    3.3 GH基因多态性检测及其与脂肪、屠体和体重性状的关联分析  68-71
      3.3.1 GH基因PCR产物的获得  68
      3.3.2 GH基因多态性检测及PCR-RFLP酶切分型  68-69
      3.3.3 GH基因与脂肪、屠体和体重性状的关联分析  69-71
  4 讨论  71-75
    4.1 LPL基因多态性及其与鸭脂肪、屠体和体重性状的关联分析  71-72
    4.2 GH基因多态性及其与鸭脂肪、屠体和体重性状的关联分析  72-73
    4.3 ADP基因多态性及其与鸭脂肪、屠体和体重性状的关联分析  73-74
    4.4 SNP影响基因功能的机制  74-75
  5 小结  75-76
第四章结论  76-79
  1 已取得的成果  76-77
  2 本研究的创新点与特色  77-78
  3 本研究的不足之处与下一步工作建议  78-79
参考文献  79-93
在读期间发表论文题录  93-95
致谢  95-96
附表1 均一化文库中有同源基因信息的EST序列的BLASTN分析  96-101
附表2 文库中有同源序列但无注释信息的EST序列的BLASTN分析  101-104

鸭脂肪组织EST鉴定、脂肪代谢相关基因多态检测及其与肉鸭脂肪、屠体和生长性状的关联分析

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