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利用体细胞核移植技术生产转单体红色荧光蛋白五指山小型猪研究

作　者: 鲁月
导　师: 尹熙俊
学　校: 延边大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 五指山小型猪 单体红色荧光蛋白 转基因猪 体细胞核移植
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


红色荧光蛋白及其突变体能实时监测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用。单体红色荧光蛋白是一种能够快速成熟的荧光蛋白,其激发与发射波长更长,具有更高的组织渗透性,毒性低,比绿色荧光蛋白成熟速度快,抗干扰能力强。我们首次构建pCX-mRFPl-pgk-neoR表达载体,探讨单体红色荧光蛋白做为报告蛋白在生产转基因五指山小型猪有效性和安全性。五指山小型猪,它具有体型小、性成熟早、遗传稳定、适应性强等特性,其血液生理生化值和心、肝、肾对药物代谢近似于人类；血型类似人类的0型血,作为实验动物被广泛研究。利用体细胞核移植技术生产具有新的遗传性状及抗病能力五指山小型猪是一种简单快速的方法,因此将外源基因导入供核细胞中显得尤为重要。实验目的是将外源基因pCX-mRFPl-pgk-neoR导入到五指山小型猪耳成纤维细胞中,比较不同转染试剂、转染方法对转染效率的影响,确定最佳的转染时间、G418筛选浓度。检测转基因与非转基因细胞形态观察变化以及对转染前后染色体进行核型分析,经PCR法鉴定证实外源基因整合在细胞基因组中。同时利用体细胞核移植技术构建重构胚,比较转基因与非转基因重构胚的卵裂率和囊胚率,最后生产转单体红色荧光蛋白五指山小型猪。结果显示：细胞汇合度为60%-80%,使用NucleofectorTM细胞核转染技术,在U-023电转程序下,能有效介导质粒转染猪耳成纤维细胞,转染率高达到83.33%。比采用FuGENE(?) HD转染试剂转染效率为65.00%和采用LipofectamineTM2000脂质体转染效率为9.70%均高,确定G418最佳筛选浓度为200μ g/mL。经核型分析发现转基因与非转因细胞正常染色体率分别是80.5%(41/50)和92%(46/50),无显著差异。将外源基因pCX-mRFPl-pgk-neoR导入到五指山小型猪耳成纤维细胞中,利用转基因细胞作为核供体生产的重构胚卵裂率是83.08%(221/266),囊胚率是11.65%(31/266)。确定以单体红色荧光蛋白基因为目标基因,对转基因体细胞核移植胚胎体外发育无影响。将685个转基因重构胚移植到3头代孕母猪体内,2头代孕母猪妊娠,其中一头代孕母猪在妊娠38天时流产6头胎儿,另一头代孕母猪顺利产出4头克隆小型猪,通过PCR、原位荧光杂交、DNA杂交技术检测证实所有后代均为转基因后代。将一头转基因克隆五指山小型猪解刨后进行组织学分析,我们发现单体红色荧光可以在五指山小型猪体内广泛表达,为器官移植、干细胞移植与分化研究提供一种标记细胞、组织、器官来源,生产的表达单体红色荧光五指山小型猪将成为理想的动物模型,这在农学和医学方面具有广扩的应用前景。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-13
Chapter 1 Literature review  13-23
  1.1 Wuzhishan minipigs  13-14
  1.2 Fluorescent proteins  14-16
    1.2.1 The development history of red fluorescent protein as a marker  14-15
    1.2.2 Monomeric red fluorescent protein (mRFPl)  15
    1.2.3 Animal modal expressing fluorescent proteins  15-16
  1.3 Transgeaic animals  16-22
    1.3.1 Techniques for genetic modifications pig  16-18
      1.3.1.1 Pronuclear microinjection  16-17
      1.3.1.2 Retroviral vectors  17
      1.3.1.3 Sperm-mediated gene transfer (SMGT)  17-18
      1.3.1.4 Embryonic stem cells  18
      1.3.1.5 Somatic cell nuclear transfer  18
    1.3.2 Generation of transgenic animal by somatic cell nuclear transfer  18-20
      1.3.2.1 The preparation of donor cells  19-20
        1.3.2.1.1 Calcium Phosphate Precipitation  19-20
        1.3.2.1.2. Electroporation  20
        1.3.2.1.3 Lipid transfection  20
    1.3.3 Analysis of transgenic animals  20-21
    1.3.4 The development prospects of genetically modified animals  21-22
  1.4 Aim of this study  22-23
Chapter 2 Methods and materials  23-31
  2.1 Animals  23
  2.2 Chemicals and media  23
  2.3 Main equipment  23-24
  2.4 Methods  24-30
    2.4.1 Construction of transgenic pCX-mRFPl-pgk-neoR vectors  24-25
    2.4.2 Generation of Wuzhishan minipigs ear fibroblast cell line (WMP)  25
    2.4.3 Selection of susceptive concentration of antibiotics G418 in Wuzhishan minipigs ear fibroblast cell line  25
    2.4.4 Transfection of pCX-mRFPl-pgk-neoR into ear fibroblasts  25-27
      2.4.4.1 FuGENE(?) HD Transfection Reagent were used to transfect ear fibroblasts  25-26
      2.4.4.2 Lipofectamine TM 2000 Transfection Reagent were used to transfect ear fibroblasts  26
      2.4.4.3 Electroporation were used to transfect ear fibroblasts  26-27
    2.4.5 WMP/mRFPl transfected fibroblasts by PCR assay  27
    2.4.6 Production of SCNT embryos  27-28
    2.4.7 Embryo transfer  28
    2.4.8 Identification of positive clones  28-29
    2.4.9 Karyotyping  29
    2.4.10 Fluorescence in situ hybridization (FISH)  29
    2.4.11 Detection of red fluorescence  29-30
  2.5 Statistical analysis  30-31
Chapter 3 Results and analysis  31-42
  3.1 Selection of Susceptive Concentration of Antibiotics G418 in Wuzhishan minipigs ear fibroblast cell line  31
  3.2 Comparison of transfection efficiency of pCX-mRFPl-pgk-neoR into ear fibroblasts  31-33
  3.3 Generation of cloned embryos by nuclear transfer of mRFPl-expressing cells  33-34
  3.4 In vitro development and mRFPl expression of SCNT embryos  34-35
  3.5 Generation of transgenic Wuzhishan minipigs  35-36
  3.6 Analysis of mRFPl expression in transgenic pigs  36-42
Chapter 4 Discussion  42-47
  4.1 Comparison of transfection efficiency of pCX-mRFPl-pgk-neoR into ear fibroblasts  42-44
  4.2 Expression of red fluorescent protein transgenic Wuzhishan minipigs  44
  4.3 Generation of transgenic Wuzhishan minipigs by somatic cell nuclear transfer  44-45
  4.4 Analysis of transgenic Wuzhishan minipigs  45-47
Chapter 5 Conclusion  47-48
Reference  48-53
Appendix Components of basic medie  53-55
Appendix B  55-56
Acknowledgement  56-57

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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